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LDH 細(xì)胞毒性檢測(cè)試劑盒

MCE 國(guó)際站：Cytotoxicity LDH Assay Kit

品牌：MedChemExpress (MCE)

存儲(chǔ)條件： -20℃,，避光保存，一年有效

簡(jiǎn)介：MCE LDH Assay Kit 是通過分析釋放到培養(yǎng)上清液中的 LDH 活性而測(cè)定細(xì)胞損傷的試劑盒,。配合使用 CCK-8 (HY-K0301) 可獲得死細(xì)胞,、活細(xì)胞數(shù)據(jù)。

概述：細(xì)胞死亡或膜損傷造成的細(xì)胞膜完整性喪失會(huì)導(dǎo)致胞漿內(nèi)酶的釋放,，通過檢測(cè)釋放到培養(yǎng)液中的酶的活性可測(cè)定細(xì)胞毒性,。乳酸脫氫酶（LDH）是細(xì)胞毒性研究中使用廣泛的標(biāo)志物之一，其存在于所有細(xì)胞類型中,，并能在質(zhì)膜受損后迅速釋放到培養(yǎng)上清中,。MCE LDH Assay Kit 是通過分析釋放到培養(yǎng)上清液中的 LDH 活性而測(cè)定細(xì)胞損傷的試劑盒,。在 LDH 的作用下，乳酸（Lactate）被氧化為丙酮酸（Pyruvate）,，NAD+被還原成 NADH,，NADH 和 INT 反應(yīng)生成橙黃色的甲臜（Formazan）。甲臜的最大吸光度值位于 490 nm 處,，且吸光度與 LDH 活性呈線性正相關(guān),。利用此原理可以測(cè)定死細(xì)胞和受損細(xì)胞的數(shù)量。本試劑盒對(duì)細(xì)胞無害,，可直接添加到含有細(xì)胞的培養(yǎng)基中,，一步檢測(cè)培養(yǎng)上清中的 LDH 活（直接法），也可以分離細(xì)胞后吸取培養(yǎng)上清進(jìn)行檢測(cè)（間接法）,，分離的細(xì)胞可用于其他實(shí)驗(yàn),。

描述：

由于細(xì)胞死亡或膜損傷導(dǎo)致細(xì)胞膜完整性喪失，導(dǎo)致某些可溶性胞漿酶釋放,。因此,，可以通過測(cè)量釋放到培養(yǎng)上清液中的這些酶的活性來測(cè)量急性細(xì)胞毒性。乳酸脫氫酶 (LDH) 是一種穩(wěn)定的酶,，存在于所有細(xì)胞類型中,，并在質(zhì)膜受損時(shí)迅速釋放到細(xì)胞培養(yǎng)基中。因此,，LDH 是細(xì)胞毒性研究中廣泛使用的標(biāo)記物,。

LDH 氧化乳酸生成 NADH，然后與某些染料反應(yīng)生成黃色,。生成顏色的強(qiáng)度與裂解的細(xì)胞數(shù)量直接相關(guān),，這表明存在細(xì)胞毒性。LDH 活性可以通過分光光度計(jì)或平板讀數(shù)器在 490 nm 處輕松量化,。

圖 1. MCE 細(xì)胞毒性 LDH 檢測(cè)試劑盒示意圖,。

MCE 細(xì)胞毒性 LDH 檢測(cè)試劑盒可直接加入細(xì)胞中，檢測(cè)培養(yǎng)上清液中的 LDH 活性（一步法,，直接法）,。或者您可以將培養(yǎng)上清液與細(xì)胞分離,，然后使用此試劑盒檢測(cè) LDH 活性（間接法）,。分離的細(xì)胞可用于其他實(shí)驗(yàn)。

圖2. 直接和間接法檢測(cè)LDH活性,。

操作說明：1. 預(yù)實(shí)驗(yàn)—確定 LDH 細(xì)胞毒性測(cè)定的最佳細(xì)胞數(shù)：1.1 先用細(xì)胞計(jì)數(shù)板計(jì)數(shù)所制備的細(xì)胞懸液中的細(xì)胞數(shù)量,，然后接種細(xì)胞；1.2 按比例依次用培養(yǎng)基等比稀釋成一個(gè)細(xì)胞濃度梯度，一般要做 5-7 個(gè)細(xì)胞濃度梯度,，每組 4-6 個(gè)復(fù)孔,；1.3 接種后培養(yǎng) 2-4 h 使細(xì)胞貼壁；1.4 在高對(duì)照孔和高對(duì)照空白孔中加入 10 μL Lysis Solution,，在低對(duì)照孔中加入 10 μL 培養(yǎng)基,，37℃ CO 培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng) 30 min；1.5 直接法：每孔吸掉 50 μL 培養(yǎng)基上清,，以剩余培養(yǎng)基及細(xì)胞作為檢測(cè)對(duì)象,，向每孔中加入 50 μL Working Solution，震蕩混勻,。1.5間接法：從每孔中吸取 50 μL 上清液至新的 96 孔板中,。而后在新的 96 孔板每孔中加入 50 μL Working Solution，震蕩混勻,。注：直接法適用于不需要收集活細(xì)胞進(jìn)行其它實(shí)驗(yàn),，間接法適用于需要收集活細(xì)胞進(jìn)行其它實(shí)驗(yàn)。根據(jù)實(shí)驗(yàn)?zāi)康倪x擇其中一種方法測(cè)定 LDH 活性,。1.6 室溫避光孵育 30 min1.7 在每孔加入 50 μL Stop Solution 后,，立即用酶標(biāo)儀測(cè)定 490 nm 處的吸光度。2.5 注：根據(jù)如下要求選擇最佳的細(xì)胞濃度：2.5 a. 高對(duì)照孔和低對(duì)照孔的 OD 值之差 > 0.2,；2.5 b. 在線性曲線上的該細(xì)胞濃度的 OD 值 < 2.0,。2. 細(xì)胞毒性檢測(cè)：2.1 在 96 孔板中接種細(xì)胞懸液（100 μL/孔，104-105）,，將培養(yǎng)板放在培養(yǎng)箱中預(yù)培養(yǎng) 24 h,；2.2 向培養(yǎng)板加入不同濃度的待測(cè)藥物；2.3 將培養(yǎng)板在培養(yǎng)箱孵育適當(dāng)時(shí)間（例如 6,、12,、24 或 48 h）；2.4 在高對(duì)照孔和高對(duì)照空白孔中加入 10 μL Lysis Solution,，在低對(duì)照孔中加入 10 μL 培養(yǎng)基，37℃ CO2培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng) 30 min,；2.5 直接法：每孔吸掉 50 μL 培養(yǎng)基上清,，以剩余培養(yǎng)基及細(xì)胞作為檢測(cè)對(duì)象，向每孔中加入 50 μL Working Solution,，震蕩混勻,；2.5 間接法：從每孔中吸取 50 μL 上清液至新的 96 孔板中。而后在新的 96 孔板每孔中加入 50 μL Working Solution,，震蕩混勻,；2.5 注：直接法適用于不需要收集活細(xì)胞進(jìn)行其它實(shí)驗(yàn)，間接法適用于需要收集活細(xì)胞進(jìn)行其它實(shí)驗(yàn)。根據(jù)實(shí)驗(yàn)?zāi)康倪x擇其中一種方法測(cè)定 LDH 活性,。2.6 室溫避光孵育 30 min,；2.7 在每孔加入 50 μL Stop Solution 后，立即用酶標(biāo)儀測(cè)定 490 nm 處的吸光度,。2.5 注：配合使用 CCK-8（HY-K0301）可獲得死細(xì)胞和活細(xì)胞數(shù)據(jù)

注意事項(xiàng)：1. 96 孔板的選擇：直接法中貼壁細(xì)胞和懸浮細(xì)胞都使用平底 96 孔板,；間接法中貼壁細(xì)胞使用平底 96 孔板，懸浮細(xì)胞使用圓底或 V 底 96 孔板,。2. 加入 Working Solution后,，吸光度與反應(yīng)時(shí)間成正比，建議 0-30 min 內(nèi)檢測(cè),。由于不同細(xì)胞差異較大,，建議第一次實(shí)驗(yàn)時(shí)，分別測(cè)定 0 min,，5 min,，10 min，20 min,，30 min 時(shí)的吸光度,，以便確定最佳反應(yīng)時(shí)間。3. 使用 96 孔板進(jìn)行檢測(cè)時(shí),，如果細(xì)胞培養(yǎng)時(shí)間較長(zhǎng),，一定要注意蒸發(fā)問題。一方面,，由于 96 孔板周圍一圈最容易蒸發(fā),，可以采取棄用周圍一圈的辦法，改加相同量的 PBS,、水或培養(yǎng)液,；另一方面，可以把 96 孔板置于靠近培養(yǎng)箱內(nèi)水源的地方,，以緩解蒸發(fā),。4. 用酶標(biāo)儀檢測(cè)前需確保每孔內(nèi)沒有氣泡，否則會(huì)干擾測(cè)定,。5. 建議采用多通道移液器,，以減小平行孔間的差異。6. 由于血清含有乳酸脫氫酶,，建議血清的使用濃度不要超過 1%,，并最好使用熱滅活血清。如果一定需要使用10% 血清,，在檢測(cè)時(shí)一定要設(shè)置背景空白（僅含培養(yǎng)基）,，以用于消除背景。7. 細(xì)胞過度生長(zhǎng)、密度過高,、離心速度過大,、培養(yǎng)箱內(nèi)外溫差過大等因素，都會(huì)造成細(xì)胞釋放乳酸脫氫酶增加,。8. 本產(chǎn)品僅限于專業(yè)人員的科學(xué)研究用,，不得用于臨床診斷或治療，不得用于食品或藥品,。9. 為了您的安全和健康,，請(qǐng)穿實(shí)驗(yàn)服并戴一次性手套操作。

銷售產(chǎn)品：Meldonium  | Phenylpyruvic acid  | Fosinopril (sodium)  | Dendrobine  | GSK461364  | Desmosterol  | Pyrazinamide  | CYP3cide  | iCRT 14  | (R)-Aminocarnitine

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