多重?zé)晒饷庖呓M化技術(shù)(Multiplex immunohistochemical,，mIHC) 也稱作酪氨酸信號(hào)放大 (Tyramide dignal amplification，TSA) 技術(shù),，是一類利用辣根過(guò)氧化酶(Horseradish Peroxidase, HRP) 對(duì)靶蛋白或核酸進(jìn)行高密度原位標(biāo)記的酶學(xué)檢測(cè)方法,。
該方法基于酪胺信號(hào)放大的多重順次免疫染色技術(shù)，允許同時(shí)檢測(cè)單個(gè)細(xì)胞或組織樣本上的多個(gè)目標(biāo)靶點(diǎn),，全面研究細(xì)胞組成,、細(xì)胞功能和細(xì)胞間相互作用。
Tips：原理：帶有染料標(biāo)記的底物酪胺 (T) 分子在過(guò)氧化氫氧化環(huán)境下，被抗體或探針固定的 HRP 轉(zhuǎn)化為具有短暫活性的中間狀態(tài) (T*)，然后被激活的中間態(tài)分子 (T*) 迅速與相接蛋白分子的富含電子區(qū)域 (酪氨酸殘基) 進(jìn)行穩(wěn)定的共價(jià)結(jié)合,，未被標(biāo)記的酪胺分子將被洗脫,，借此實(shí)現(xiàn)對(duì)抗原的特異性染色。由于相接的蛋白 (包括 HRP,，抗體,，目標(biāo)抗原) 都含有大量的酪氨酸結(jié)合位點(diǎn)，所以目標(biāo)抗原處會(huì)富集大量標(biāo)記分子,，使信號(hào)被有效放大 (圖 2),。
■ IHC 與 mIHC
：簡(jiǎn)單來(lái)說(shuō),，mIHC 屬于 IHC 的升級(jí)版本,！
Tips：2. 常規(guī)免疫組化受傳統(tǒng)染色成像的限制，靶標(biāo)少于 3 個(gè),，無(wú)法完整分析組分信息,。而多重?zé)晒饷庖呓M化可實(shí)現(xiàn)多因子共定位，可以獲取更多的生物信息,，且樣本需求量較少。
圖 4. 癌組織單色 IHC（上）和多色譜 mIHC（下）驗(yàn)證[3]
■ mIHC 與 IF
那么問(wèn)題來(lái)了,，mIHC 與 IF 又有什么區(qū)別呢,？既然最后的成像都是熒光圖像，那按照 IF 實(shí)驗(yàn)就行哇,，為什么要去做 mIHC 呢,？？,？
：其實(shí),，mIHC 作為一種新型的免疫化學(xué)技術(shù)，其價(jià)值自然會(huì)優(yōu)于傳統(tǒng)的 IF 實(shí)驗(yàn)，并且二者在原理及操作步驟上均有差異,。
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圖 3. mIHC（左）和常規(guī)三色熒光檢測(cè)示意圖（右）
■ 應(yīng)用一：腫瘤機(jī)制探究
Gang Wei 等人收集了透明細(xì)胞腎細(xì)胞癌 (ccRCC) 患者的腎周脂肪 (Perinephric adipose tissue, PAT) 和皮下白色脂肪 ( White adipose tissue,WAT) 組織樣本,，發(fā)現(xiàn)腫瘤鄰近脂肪細(xì)胞的解偶聯(lián)蛋白 1 (Uncoupling protein 1, UCP1) 表達(dá)高于遠(yuǎn)端脂肪細(xì)胞（WAT 褐變的典型特征之一是 UCP1 的表達(dá)上調(diào)）。
此外,，腫瘤細(xì)胞的 qRT-PCR,、mIHC 檢測(cè)和免疫印跡均表明，在聯(lián)合注射 BAC-shPgc1a或 BAC-shUcp1 相關(guān)的腫瘤中,，脂肪細(xì)胞促進(jìn)的 UCP1 水平上調(diào)被抑制(圖 4),。
進(jìn)一步的研究發(fā)現(xiàn)，ccRCC 細(xì)胞分泌甲狀旁腺激素相關(guān)蛋白 PTHrP 以通過(guò) PKA 激活促進(jìn) PAT 褐變,，而 PAT 介導(dǎo)的產(chǎn)熱導(dǎo)致過(guò)量乳酸的釋放以增強(qiáng) ccRCC 的生長(zhǎng),、侵襲和轉(zhuǎn)移色[2]。
圖 4. UCP1 水平變化的檢測(cè)[4]
mIHC (A), qRT-PCR (BG) and Immunoblotting (C) 檢測(cè) UCP1 水平,。空白對(duì)照組：786-O; 陰性對(duì)照組：786-O+BAC-Scramble,；敲低 Pgc1a 實(shí)驗(yàn)組：786-O+ BAC-shPgc1a；敲低Ucp1實(shí)驗(yàn)組：786-O+ BAC-shUcp1,。
■ 應(yīng)用二：免疫抑制性腫瘤微環(huán)境鑒定
貨號(hào) | 產(chǎn)品名稱 | Ex/Em (nm) |
HY-D1838 | Vari Fluor 350 TSA（200×） | 347/448 |
HY-D1837 | Vari Fluor 488 TSA（200×） | 490/515 |
HY-D1832 | Vari Fluor 532 TSA（200×） | 527/558 |
HY-D1836 | Vari Fluor 555 TSA（200×） | 555/565 |
HY-D1835 | Vari Fluor 594 TSA（200×） | 590/617 |
HY-D1834 | Vari Fluor 640 TSA（200×） | 617/639 |
| HY-D1831 | Vari Fluor 620 TSA（200×） | 617/639 |
| HY-D1833 | Vari Fluor 680 TSA（200×） | 617/639 |
| HY-D1839 | Biotin TSA（200×） | / |
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參考文獻(xiàn)
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