胰酶使用注意：

1,、在使用胰酶細(xì)胞消化液的過程中要特別注意避免消化液被細(xì)菌污染,。

2,、胰酶細(xì)胞消化液消化細(xì)胞時間不宜過長,，否則細(xì)胞鋪板后生長狀況會較差,。

貼壁細(xì)胞的消化：

1、吸去培養(yǎng)液,，用無菌的PBS,、Hanks液或無血清培養(yǎng)液洗滌細(xì)胞一次,，以去除殘余的血清

2、加入少量胰酶細(xì)胞消化液,，略蓋過細(xì)胞即可,，根據(jù)胰酶效率差異可以增加惑減少胰酶用量。室溫放置30秒至2分鐘（不同的細(xì)胞消化時間有所不同）

3,、顯微鏡下觀察,，細(xì)胞明顯收縮，并且肉眼觀察培養(yǎng)器皿底部發(fā)現(xiàn)細(xì)胞的形態(tài)發(fā)生明顯的變化呈白茫狀,；或者用槍吹打細(xì)胞發(fā)現(xiàn)細(xì)胞剛好可以被吹打下來,。

4、此時吸除胰酶細(xì)胞消化液,。加入含血清的細(xì)胞培養(yǎng)液,，吹打下細(xì)胞，即可直接用于后續(xù)實驗如果發(fā)現(xiàn)消化不足,，則加入胰酶細(xì)胞消化液重新消化,。

如果發(fā)現(xiàn)細(xì)胞消化時間過長，未及吹打細(xì)胞,，細(xì)胞已經(jīng)有部分直接從培養(yǎng)器皿底部脫落,，直接用胰酶細(xì)胞培養(yǎng)液把細(xì)胞全部吹打下來。1000-2000g離心1分鐘,，沉淀細(xì)胞,，盡量去除胰酶細(xì)胞消化液后，加入含血清的培養(yǎng)液重新懸浮細(xì)胞,，即可用于后續(xù)實驗,。

常用的細(xì)胞消化液為胰蛋白酶（Trypsin），EDTA等,，其功能主要是使細(xì)胞間的蛋白質(zhì)（如細(xì)胞外基質(zhì)）水解,，改變細(xì)胞間的連接，使組織或細(xì)胞片分散成單個細(xì)胞,，制成細(xì)胞懸液用于進(jìn)一步的實驗,。

影響消化速度的因素較多，主要有胰酶溶液的活性（配制條件,、凍存或4℃保存時間長短,、是否反復(fù)凍融、化凍后存放時間及溫度等）,、消化時的溫度（氣溫,、細(xì)胞培養(yǎng)瓶及胰酶溶液的溫度）以及所加胰酶溶液的多少等 。

加入胰蛋白酶-EDTA溶液，視細(xì)胞瓶的大小加入體積為2ml或更多（依培養(yǎng)器皿的大小而定）,，以使充分浸潤,；

一般消化時間約為1至3分鐘，肉眼觀察瓶底由半透明（細(xì)胞單層連接成片）轉(zhuǎn)為透明,、點狀（出現(xiàn)細(xì)小空隙）時,，棄去細(xì)胞消化液，或看見培養(yǎng)瓶壁呈白茫狀即可,。并加入適量的培養(yǎng)液終止消化,，吹打分散；如見大量細(xì)胞片狀脫落,，已消化過頭,，則不能頃倒消化液而直接進(jìn)行下一步操作。（消化過頭,，可造成大量細(xì)胞從瓶壁上脫下,，甚至造成細(xì)胞破碎。由于血清含有非特異性胰蛋白酶抑制劑,，所以加入培養(yǎng)基可以終止反應(yīng),。

胰酶配置方法：

1、培養(yǎng)液配制,，方便好用,，對細(xì)胞影響小，并且培養(yǎng)液的ph值正好適合胰蛋白酶的溶解

2,、生理鹽水配制,，要先調(diào)ph值7.2到7.4（①胰酶（1：250） 2.5 克②EDTA-Na 0.3克③NaCl 8.0克④KCl 0.4克⑤Glucose 1.0克⑥Phenol Red 0.005克⑦Water 1000 mL磁力攪拌2-3小時，調(diào)pH 7.8-8.0,，過濾除菌,。）

3、pbs（0.1%胰酶溶液的配制：稱取胰酶粉末0.1g,，先用少許滅菌過的PBS調(diào)成糊狀,，然后補(bǔ)足到100ml。置室溫攪拌4小時或冰箱內(nèi)過夜,，過濾滅菌,，分裝，4℃保存?zhèn)溆?。? 或是hanks或是D-hanks液配制（1.稱取胰蛋白酶粉末置燒杯中,，先用少許D-Hanks 平衡鹽溶液（pH7.2 左右）調(diào)成糊狀，然后再補(bǔ)足D-Hanks 平衡鹽溶液,，攪拌混勻,，置室溫4 小時或冰箱過夜,，并不斷攪拌振蕩；2.次日,，先用濾紙粗濾，再進(jìn)行過濾除菌,，分裝入瓶中,，低溫冰箱保存?zhèn)溆茫Ｓ脻舛葹?.25% 或0.125%,。胰蛋白酶溶液偏酸,，使用前可調(diào)用碳酸氫鈉溶液調(diào)pH 至7.2 左右。）

一般0.45微米的一次性濾器過濾除菌,，至于作用效果,，需要消化一次細(xì)胞感覺一下，因為不同廠家的酶不一樣,，有的作用溫和,，有的作用劇烈。

4,、是否需要四度放置過夜,，取決于你的胰酶的純度。過去的胰酶純度不高,，所以難以溶解,，需要四度過夜. 而現(xiàn)在的胰酶純度都很高，就沒有必要四度過夜,。從理論上來說,，四度放置過夜，給細(xì)菌生長的機(jī)會,，盡管過濾可以出去細(xì)菌,，可是出不掉其代謝產(chǎn)物。

胰蛋白酶不溶,有絮狀物的原因,，考慮有：

1,、過期或是酶已經(jīng)部分變性

2、溶液ph值不對

3,、在沒過濾之前的絮狀沉淀是正?，F(xiàn)象，因胰酶多取自動物胰腺,，沉淀為組織塊,，過濾后即可