檢測原理

試劑盒采用雙抗原一-步夾心法酶聯(lián)免疫吸附試驗(ELISA) ,。往預先包被病毒性腹瀉病毒抗ti的包被微孔中，依次加入標本,、HRP標記的檢測抗原,，經過溫育并徹di洗滌。用底物TMB顯色,，TMB在過氧化物酶的催化下轉化成藍色,，并在suan的作用下轉化成最終的黃色。用酶標儀在450NM波長下測定吸光度(OD值) ,，與CUTOFF值相比較,，從而判定標本中豬病毒性腹瀉病毒(BVDV) 的存在與否。

樣品收集,、處理及保存方法

1.血清:使用不含熱原和內毒素的試管,，操作過程中避免任何細胞刺激，收集血液后,，3000轉離心10分鐘將血清和紅細胞迅速小心地分離,。

2.血漿: EDTA、檸檬suan鹽或肝素抗凝,。3000轉離心30分鐘取上清,。

3.細胞上清液: 3000轉離心10分鐘去除顆粒和聚合物。

4.組織勻漿:將組織加入適量生理鹽水搗碎,。3000轉 離心10分鐘取上清,。

5.保存:如果樣本收集后不及時檢測，請按一次用量分裝,，凍存于-20°C,， 避免反

復凍融，在室溫下解凍并確保樣品均勻地充分解凍,。

自備物品

1.酶標儀(450NM)

2.高精度加樣器及槍頭: 0.5-10UL,、 2-20UL、 20-200UL,、 200-1000UL

3.37℃恒溫箱

操作注意事項

1.試劑盒保存在2-8°C，使用前室溫平衡20分鐘。從冰箱取出的濃縮洗滌液會有結晶,，這屬于正?，F(xiàn)象，水浴加熱使結晶完quan溶解后再使用,。

2.實驗中不用的板條應立即放回自封袋中,，密封(低溫干燥)保存。

3.預處理后的樣本請按照操作步驟用樣ben稀釋ye適當稀釋以達到試劑盒的的最jia檢測效果,。.

4.嚴格按照說明書中標明的時間,、加液量及順序進行溫育操作。

5.所有液體組分使用前充分搖勻,。

大鼠磷酸化蛋白激酶C(P-PKC)ELISA試劑盒

常用方法：

1. 夾心法：

夾心法常用于檢測大分子抗原,，一般的操作步驟為:

a. 將具有專一性的抗ti固著（coating）于塑膠孔盤上，完成后洗去多余抗ti

b. 加入待測檢體,，檢體中若含有待測的抗原,，則其會與塑膠孔盤上的抗ti進行專一性鍵結

c. 洗去多余待測檢體，加入另一種對抗原專一的一次抗ti,，與待測抗原進行鍵結

d. 洗去多余未鍵結一次抗ti,，加入帶有酶的二次抗ti，與一次抗ti鍵結

e. 洗去多余未鍵結二次抗ti,，加入酶底物使酵素呈色,，以肉眼或儀器讀取呈色結果

原理：針對抗原分子上2個不同抗原決定簇的單克隆抗ti分別作為固相抗ti和酶標抗ti，將大分子抗原分別制備固相抗原和酶標抗原結合物,。

2. 間接法

間接法常用于檢測抗ti,，一般的操作步驟為：

a. 將已知的抗原固著于塑膠孔盤上，完成后洗去多余的抗原,。

b. 加入待測檢體,，檢體中若含有待測的一次抗ti，則其會與塑膠孔盤上的抗原進行專一性鍵結,。

c. 洗去多余待測檢體,，加入帶有酶的二次抗ti，與待測的一次抗ti鍵結,。

d. 洗去多余未鍵結二次抗ti,，加入酶底物使酶呈色，藉儀器（ELISA reader）測定塑膠盤中的吸光值（OD值）,，以評估有色終產物的含量即可測量待測抗ti的含量,。

原理：利用酶標記的抗抗ti以檢測已與固相結合的受檢抗ti。

3. 競爭法

競爭法是一種較少用到的ELISA檢測機制,，一般用于檢測小分子抗原,，其操作步驟為：

a. 將具有專一性的抗ti固著于塑膠孔盤上，完成后洗去多余抗ti

b. 加入待測檢體，使檢體中的待測抗原與塑膠孔盤上的抗ti進行專一性鍵結

c. 加入帶有酶的抗原,，此抗原也可與塑膠孔盤上的抗ti進行專一性鍵結,，由于塑膠孔盤上固著的抗ti數(shù)量有限，因此當檢體中抗原的量越多,，則帶有酶的抗原可鍵結的固著抗ti就越少,，亦即，兩種抗原皆競相與塑膠孔盤上抗ti鍵結,，即所謂競爭法之由來,。

d. 洗去檢體與帶有酶的抗原，加入酶底物使酶呈色,，當檢體中抗原量越多,，代表塑膠孔盤內留下之帶有酶的抗原越少，顯色也就越淺,。

e. 當需要偵測無法獲得兩種以上單一性抗ti的抗原,，或是不易得到足夠的純化抗ti以固著于孔盤上時，一般會考慮使用競爭法ELISA,。

標本要求 :

1．不能檢測含NaN3的樣品,，因NaN3辣根過氧化物酶的（HRP）活性。

2．標本采集后盡早進行提取,，提取按相關文獻進行,，提取后應盡快進行實驗。若不能馬上進行試驗,，可將標本放于-20℃保存,，但應避免反復凍融。

3.各步加樣均應使用加樣器,，并經常校對其準確性,，以避免試驗誤差。一次加樣時間控

制在5分鐘內,，如標本數(shù)量多,，推薦使用排槍加樣。

4.請每次測定的同時做標準曲線,，做復孔,。如標本中待測物質含量過高(樣本OD值大于

標準品孔孔的OD值)，請先用樣品稀釋液稀釋一定倍數(shù)(n倍) 后再測定,，計算時請

后乘以總稀釋倍數(shù)(xnx5)

5.封板膜只限一次性使用,，以避免交叉污染。

6.底物請避光保存,。

7.嚴格按照說明書的操作進行,，試驗結果判定必須以酶標儀讀數(shù)為準.

8.所有樣品,，洗滌液和各種廢棄物都應按傳染物處理。

9.本試劑不同批號組分不得混用,。

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