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多肽純常見15個(gè)問題

閱讀：496 發(fā)布時(shí)間：2023-2-16

1、檢測(cè)肽純度的一般方法是什么,？

它通常由高效液相色譜法（HPLC）測(cè)定。

2,、肽含量和肽純度有什么區(qū)別？

肽不僅包含正確的肽,，還包含雜質(zhì),，例如生產(chǎn)中的水和有機(jī)鹽。肽純度是指相對(duì)于所有雜質(zhì)（水分除外）正確肽的數(shù)量,。然而,，肽含量是目標(biāo)肽相對(duì)于樣品中其他所有物質(zhì)的百分比，通常由 N 元素分析和氨基酸分析確定,。因此,，即使肽純度達(dá)到99%，考慮到水和有機(jī)鹽,，含量仍可能為70%-80%,。

3、肽分離純化的技術(shù)是什么,？

見的技術(shù)是反相高效液相色譜 (RP-HPLC),。

4、RP-HPLC 中通常使用哪種流動(dòng)相進(jìn)行肽分離和純化,？

見的流動(dòng)相是水和乙腈,，三充當(dāng)離子對(duì)試劑。根據(jù)不同的肽段,，采用合適的梯度洗脫進(jìn)行分離,。

5、為什么在流動(dòng)相中添加 TFA 作為離子對(duì)試劑,？是否有任何其他流動(dòng)相或離子對(duì)試劑可用于肽分離和純化,？

TFA可用于調(diào)節(jié)流動(dòng)相的pH值，作為離子對(duì)試劑與多肽相互作用,，增強(qiáng)分離效果,，顯著改善峰形。

其他用于多肽分離純化的流動(dòng)相或離子對(duì)試劑包括乙酸體系,、磷酸體系,、鹽酸體系、七氟丁酸等,，可通過調(diào)節(jié)pH達(dá)到很好的分離效果,。

6、如何溶解多肽,？

大多數(shù)肽可以溶解在超純水中,。對(duì)于一些不溶性肽，需要先分析氨基酸序列,。酸性肽可先溶于少量堿性溶液（如0.1%氨水）,，然后稀釋至所需濃度,。作為堿性肽，可溶于少量酸性溶液（如乙酸,、）,，然后稀釋至所需濃度。對(duì)于疏水肽,，可溶于強(qiáng)極性有機(jī)溶劑,，如DMF、甲醇,、丙醇,、異丙醇、DMSO等,。

7,、RP-HPLC中常用的色譜填料有哪些？

見的填料是 C18,、C8 和 C4 反相色譜柱,。

8、純化中如何選擇色譜填料,？

不同序列的肽在理化特性和疏水性方面表現(xiàn)出很大差異,。在大多數(shù)情況下，C18 色譜柱對(duì)分子量小于 4000 或親水性的肽段的分離,。C4 柱適用于分子量超過 5000 或疏水末端,。C8列介于C18和C4之間，其效果更類似于C18,。對(duì)于一些特殊的選擇性肽段,，也可以選擇苯基柱和聚合物柱。

9,、純化中選擇聚合物填料的原則是什么,？

當(dāng)需要更高的 pH 或溫度時(shí)，具有寬 pH 范圍的聚合物 HPLC 柱可能適用于純化,。它們?cè)?/span>pH條件下不會(huì)降解,，因此可以使用強(qiáng)酸和強(qiáng)堿作為流動(dòng)相進(jìn)行分離和純化。

10,、什么會(huì)影響多肽純化的結(jié)果,？

影響因素很多，主要包括流動(dòng)相,、色譜柱類型,、柱溫、波長(zhǎng)、色譜儀性能等,。這些差異可能會(huì)導(dǎo)致最終結(jié)果出現(xiàn)錯(cuò)誤,。

11、頻繁的基線漂移可能是什么原因,？如何解決？

反相分離中基線漂移的主要原因是固定 TFA 濃度的梯度洗脫會(huì)導(dǎo)致 210-220 nm 處的吸收基線發(fā)生偏移,。建議使檢測(cè)波長(zhǎng)盡可能接近215 nm,，以減少或消除TFA吸收光譜變化對(duì)基線漂移的影響。此外,，與溶劑 B 相比,，溶劑 A 中添加的 TFA 減少 15% 可以補(bǔ)償基線漂移。例如,，如果溶劑 A 中的 TFA 濃度為 0.1%,，則建議溶劑 B 中添加 0.085%

12、反相色譜純化后,，如何從最終產(chǎn)品中去除流動(dòng)相中的TFA,、乙腈等雜質(zhì)？

只要不超過耐受范圍,，凍干可能是去除大部分 TFA 和乙腈的和的方法,。但該方法不能滿足一些對(duì)TFA含量要求較高的多肽類藥物的要求。應(yīng)與它們進(jìn)行特殊的鹽轉(zhuǎn)化和脫鹽,。

13,、肽的一般鹽形式有哪些？如何轉(zhuǎn)換鹽形式或脫鹽,？

大多數(shù)肽在TFA系統(tǒng)下純化,，因此TFA鹽是見的形式，其次是乙酸鹽和鹽酸鹽形式,，很少有肽藥物是特殊鹽形式,。離子交換和 HPLC 是的鹽轉(zhuǎn)化方法，而 G25（GE Healthcare 的葡聚糖凝膠）柱可用于脫鹽,。

14,、TFA 是否僅用于調(diào)節(jié)緩沖液中的 pH 值？TFA 濃度越高,，基線漂移越嚴(yán)重,。這是否意味著如果緩沖液的 pH 值允許，TFA 的濃度越低越好,？

TFA可以作為離子對(duì),，濃度通常在0.05-0.1%左右。濃度過高會(huì)使溶液過酸，影響色譜柱的使用時(shí)間,。

同時(shí),，TFA 可以抑制硅膠表面的硅烷醇基團(tuán)，改善堿性化合物的峰形,。如果使用 0.1% TFA 有時(shí)分離效果不好,，可以嘗試 0.2% TFA，但使用后需要立即沖洗色譜柱,。

在梯度洗脫時(shí),，由于基線漂移，它對(duì)制備的影響很小,。

15,、為什么肽樣品需要在上樣柱前進(jìn)行預(yù)處理？有哪些制備方法,？

制備柱更容易被污染,，因?yàn)榕c分析柱相比，它們處理的樣品更多,。因此,，需要對(duì)樣品進(jìn)行預(yù)處理以延長(zhǎng)色譜柱的使用時(shí)間。主要有五種方法：過濾,、離心,、柱前過濾和在線過濾。

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