流式熒光檢測(cè)技術(shù)又叫液相懸浮芯片技術(shù),，自誕生以來(lái),，由于其靈敏而準(zhǔn)確的光學(xué)編碼鑒別、快速的反應(yīng)動(dòng)力學(xué),、靈活的檢測(cè)項(xiàng)目組合,、可實(shí)現(xiàn)定量分析以及同時(shí)適用于蛋白與核酸分子檢測(cè)等特點(diǎn)而成為多重指標(biāo)聯(lián)合檢測(cè)的技術(shù)平臺(tái)。

  熒光編碼微球是該項(xiàng)技術(shù)的靈魂,，它不僅僅影響待檢測(cè)物的重?cái)?shù),，檢測(cè)試劑的穩(wěn)定性，其表面活性基團(tuán)的數(shù)量（用于連接抗原或核酸）更是直接影響檢測(cè)的靈敏度和準(zhǔn)確度,。因此在考慮一種熒光編碼微球適不適合做流式熒光法檢測(cè)試劑盒的原料時(shí),，其表面活性基團(tuán)是個(gè)非常重要的指標(biāo)。

圖1 熒光編碼微球的重要參數(shù)

  目前市面上大部分熒光編碼微球表面采用羧基修飾,，廠家一般也會(huì)給出他們生產(chǎn)的微球表面的羧基量,，一般通過(guò)滴定測(cè)得,，單位為µeq/g。如圖2,，顯示了碧芯生物3μm球的表面滴定數(shù)據(jù),。一般而言，微球的粒徑越小,，比表面積就越大（與粒徑的平方成反比）,，此時(shí)達(dá)到相同的羧基密度，小粒徑的微球的表面滴定數(shù)據(jù)就會(huì)越大,。對(duì)于相同粒徑的熒光編碼微球,，表面滴定數(shù)據(jù)越大說(shuō)明表面羧基密度越高。

圖2  碧芯生物3μm球的表面滴定數(shù)據(jù)

然而在實(shí)際樣本的檢測(cè)中,，表面羧基滴定數(shù)據(jù)僅能作為參考,，卻并不能直接反映表面偶聯(lián)抗體密度。例如,，我們并不知道當(dāng)表面的羧基滴定度達(dá)到多少時(shí),，我們可以將捕獲抗體滿滿的結(jié)合在微球表面；此外,，當(dāng)與其他活性基團(tuán)修飾的熒光編碼微球比較時(shí)（比如與表面親和素修飾的微球比較時(shí)）,，表面多少的羧基量的球與表面多少親和素量的微球能結(jié)合同樣多的捕獲抗體呢？因此,，僅得知羧基修飾的熒光編碼微球表面羧基量來(lái)判斷其是否可作為流式熒光法檢測(cè)試劑盒的原料是遠(yuǎn)遠(yuǎn)不夠的,，只有直接測(cè)定微球結(jié)合捕獲抗體后微球表面的抗體密度，甚至計(jì)算出平均每個(gè)熒光編碼微球上能結(jié)合抗體的最大數(shù)量,，才能真正直觀反映微球的品質(zhì),。然而，想要直接測(cè)定微球表面能結(jié)合的捕獲抗體的量比較困難,。有人采用間接法,，也就是先將已知濃度且過(guò)量的抗體偶聯(lián)到已知數(shù)量的熒光編碼微球，分離微球后通過(guò)測(cè)定溶液中殘余的抗體量來(lái)測(cè)定微球表面的抗體結(jié)合量,。這種方法由于采用間接法,，分離時(shí)溶液中的抗體損失都會(huì)計(jì)算成微球所結(jié)合的抗體，且測(cè)定溶液中抗體殘余的檢測(cè)一般采用顯色法,，該方法的靈敏度較差,，因此該方法測(cè)到的數(shù)據(jù)不夠準(zhǔn)確。此外,，該方法相對(duì)繁瑣,，如果作為質(zhì)量控制的方法，不夠便捷。

    面對(duì)這一問(wèn)題,，碧芯公司也經(jīng)過(guò)反復(fù)的思考和大量的研究摸索,，建立了能準(zhǔn)確測(cè)定熒光編碼微球表面能結(jié)合的最大抗體量的方法。如圖3所示,，我們采用藻紅蛋白替代抗體,，將藻紅蛋白偶聯(lián)到熒光編碼微球表面后，采用流式細(xì)胞儀測(cè)定微球表面的藻紅蛋白熒光信號(hào)（模擬表面捕獲抗體）,。藻紅蛋白偶聯(lián)的量越多,，熒光越強(qiáng)，從而構(gòu)建PE的熒光強(qiáng)度與PE偶聯(lián)量的相關(guān)性,。計(jì)算出微球表面的藻紅蛋白數(shù)量,。由于該方法采用直接測(cè)定微球表面的藻紅蛋白熒光信號(hào)，因此更能準(zhǔn)確反映微球表面結(jié)合藻紅蛋白的數(shù)量,。

圖3 基于藻紅蛋白的微球偶聯(lián)抗體容量評(píng)價(jià)方法的建立

表1 碧芯生物Beadstar-mPlex®系列光編碼微球表面PE偶聯(lián)密度檢測(cè)結(jié)果

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Beadstar-mPlex®磁性熒光編碼微球共計(jì)3種尺寸,，每種尺寸微球可編碼30-70重熒光,。表面修飾集團(tuán)包括：Avidin、氨基,、羧基,。具體參數(shù)如下表所示：