實驗條件的選擇

在 ELISA 中,，選擇各種實驗條件很重要，包括：

(1)固相載體的選擇：許多物質都可以用作固相載體,，如聚氯乙烯,、聚苯乙烯,、聚丙烯酰胺、纖維素等,?？梢允强装濉⒃嚬?、珠子等形式,，常用的是40孔聚苯乙烯凹孔板。無論是何種載體,，使用前都可以進行篩選：包被等量的抗原，在相同的實驗條件下進行反應,。

(2)包被抗體(或抗原)的選擇：當抗體(或抗原)吸附在固相載體表面時,，要求純度好，一般要求pH在9.0～9.6之間在吸附過程中,。吸附溫度,、時間和蛋白質的量也有一定的影響，一般4℃18～24小時,。蛋白質包被的最佳濃度需要滴定：即在包被不同的蛋白質濃度（0.1,、1.0和10μg/ml等）后，在其他測試條件相同的情況下觀察陽性樣品的OD值.選擇 OD 值最高,、蛋白質含量最少的濃度,。對于大多數(shù)蛋白質，通常為 1-10 μg/ml,。

（3）酶標抗體工作濃度的選擇：首先用直接ELISA法滴定初始效價（見酶標抗體部分）,。然后固定其他條件或采用“方陣法"（包被材料、待測樣品對照品和酶標抗體處于不同稀釋度）在正式實驗系統(tǒng)中準確滴定工作濃度,。

(4)酶底物和氫供體的選擇：氫供體的選擇要求便宜,、安全、顯色反應明顯,，但本身是無色的,。一些供氫體（如OPD等）具有潛在的致癌作用，應予以保護,。有條件的應選用非致癌,、高靈敏度的供氫體，如TMB,、ABTS等,，都是比較滿意的供氫體。底物作用一段時間后,，應加入強酸或強堿停止反應,。通常底物作用時間為10-30分鐘,。底物溶液必須新鮮配制，特別是在使用前應立即加入 H2O2,。

安全性

1． 避免直接接觸終止液和底物A,、B。一旦接觸到這些液體,，請盡快用水沖洗,。

2． 實驗中不要吃喝、抽煙或使用化妝品,。

3． 不要用嘴吸取試劑盒里的任何成份,。

4． 試劑應按標簽說明書儲存，使用前恢復到室溫,。稀稀過后的標準品應丟棄,，不可保存。

5． 實驗中不用的板條應立即放回包裝袋中,，密封保存,，以免變質。

6． 不用的其它試劑應包裝好或蓋好,。不同批號的試劑不要混用,。保質前使用。

7． 使用一次性的吸頭以免交叉污染,，吸取終止液和底物A,、B液時，避免使用帶金屬部分的加樣器,。

8． 使用干凈的塑料容器配置洗滌液,。使用前充分混勻試劑盒里的各種成份及樣品。

9． 洗滌酶標板時應充分拍干,，不要將吸水紙直接放入酶標反應孔中吸水,。

10． 底物A應揮發(fā)，避免長時間打開蓋子,。底物B對光敏感,，避免長時間暴露于光下。避免用手接觸,，有毒,。實驗完成后應立即讀取OD值。

11． 加入試劑的順序應一致,，以保證所有反應板孔溫育的時間一樣,。

12． 按照說明書中標明的時間、加液的量及順序進行溫育操作,。

自備材料

1． 蒸餾水,。

2． 加樣器：5ul,、10ul、50ul,、100ul,、200ul、500ul,、1000ul,。

3． 振蕩器及磁力攪拌器等。

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