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產(chǎn)品貨號：D0204P

儲存條件：-20℃

產(chǎn)品組分

產(chǎn)品簡介

基于重組原理的無縫克隆技術(shù)，作為新一代的克隆方法,，不依賴繁瑣的酶切,、連接步驟,，也不需要末端補平等操作，依據(jù)DNA片段與線性化載體末端的15~25nt同源序列的重組,，可將插入片段克隆至任意線性載體的任意位點,，載體自連背景極低,，是一種簡單、快速,、高效的DNA定向克隆技術(shù)。

DNA Assembly MixPLUS無縫克隆試劑盒最快僅需5分鐘即可完成單片段重組,，且陽性率高于95%。Mix中添加的輔助因子,，有效提高克隆陽性率；經(jīng)優(yōu)化的反應(yīng)體系,，能夠一定程度上耐受未純化PCR產(chǎn)物中含有的雜質(zhì)。升級版的無縫克隆試劑盒具有更高的陽性率,、更好的兼容性。

使用簡單 —— 兼容PCR與酶切體系,，省去繁瑣的純化步驟

超高效率 —— 可以穩(wěn)定支持5-6片段在同一克隆體系

穩(wěn)定可靠 —— 37℃放置一周或凍融30次,，無明顯下降

實驗步驟

1,、實驗流程概要

2,、線性化克隆載體制備

選擇合適的克隆位點，對載體進(jìn)行線性化,，載體的線性化可以通過酶切或反向 PCR 擴(kuò)增完成。

① 酶切制備

推薦使用LabFD™快速內(nèi)切酶進(jìn)行雙酶切，使載體線性化wan 全,，以降低轉(zhuǎn)化背景(假陽性克隆),；若使用單酶切進(jìn)行線性化,，可以適當(dāng)延長酶切時間以減少環(huán)狀質(zhì)粒殘留。

注1：經(jīng)雙酶切進(jìn)行線性化的載體無需去磷酸化,，經(jīng)單酶切則需要去磷酸化,；

注2：酶切完成后，應(yīng)將快速內(nèi)切酶失活或?qū)δ康漠a(chǎn)物純化后再用于重組反應(yīng),。

② 反向 PCR 擴(kuò)增制備

為減少擴(kuò)增突變的引入,，推薦使用高保真PCR Mix進(jìn)行擴(kuò)增。推薦使用預(yù)線性化質(zhì)粒作為模板,，以減少環(huán)狀質(zhì)粒模板殘留對克隆陽性率的影響,。

3、插入片段PCR引物設(shè)計

PCR引物的5' 端必須包含與其相鄰片段（插入片段或載體）末端同源的15~25 nt（推薦18nt）序列,。假如載體為粘性末端,，且3'端突出，則引物設(shè)計必須包含突出部分,；若5'端突出，則引物設(shè)計可以包含突出部分，也可以不包含,。

插入片段正向擴(kuò)增引物：

5'—上游載體末端同源序列+酶切位點（可選）+ 基因特異性正向擴(kuò)增序列— 3'

插入片段反向擴(kuò)增引物：

3'—基因特異性反向擴(kuò)增序列+酶切位點（可選）+下游載體末端同源序列—5'

注1：盡量選擇無重復(fù)序列且GC含量均勻的區(qū)域進(jìn)行克隆,，當(dāng)載體克隆位點上下游25 nt區(qū)域內(nèi)GC含量為40%~60%時,，重組效率zui高,；

注2：本試劑盒所提供的 pUC 19 載體（Ampr）連接端序列如下：

4,、插入片段的 PCR 擴(kuò)增

推薦使用高保真PCR Mix進(jìn)行擴(kuò)增,，以減少擴(kuò)增突變的引入。建議使用純化后的PCR產(chǎn)物進(jìn)行無縫克隆反應(yīng),，若PCR產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳鑒定為特異性擴(kuò)增產(chǎn)物,，可直接使用,，但加樣體積不應(yīng)超過總反應(yīng)體積的20%,。

5、重組反應(yīng)

①于冰水浴中配置以下反應(yīng)體系：

a.最適載體用量(ng)=0.02×載體堿基對數(shù)，即0.03pmol,。

b.插入單片段,，最適片段用量（ng）= 0.04×片段堿基對數(shù)；

插入多片段,，每片段zui適用量（ng）= 0.02×片段堿基對數(shù),。

注1：若插入單片段的長度大于載體，則應(yīng)互換載體與插入片段用量,；

注2：若插入片段的長度小于200 bp,，則插入片段應(yīng)使用5倍載體用量；

注3：若按上述公式計算得到的用量超過zui低/zui高值,，則建議直接按zui低/最高用量使用,；

注4：載體片段過長,、插入片段過長克隆陽性率均會降低。

重組反應(yīng)體系配制完成后,，用移液槍輕輕吸打混勻各組分,，避免產(chǎn)生氣泡，切勿渦旋,。

② 將反應(yīng)體系置于50℃,，反應(yīng)5~60min。

注1：推薦使用 PCR 儀等溫控比較精準(zhǔn)的儀器進(jìn)行反應(yīng),，反應(yīng)時間不足或太長克隆效率均會降低,；

注2：插入1-2個片段時，推薦反應(yīng)時間5-15min,，插入3-5個片段時,，推薦反應(yīng)時間15-30min；

注3：當(dāng)載體骨架在 10 kb 以上或插入片段在4 kb以上時,，建議延長反應(yīng)時間到30-60min

注4：50℃反應(yīng)完成后,，建議進(jìn)行瞬時離心，將反應(yīng)液收集至管底,。

③ 將反應(yīng)液離心管置于冰上冷卻,，之后進(jìn)行轉(zhuǎn)化或者儲存于-20℃。

注1：-20℃儲存的重組產(chǎn)物,，建議在1周內(nèi)使用,。

6、重組產(chǎn)物轉(zhuǎn)化

取5~10μl反應(yīng)液,，加入到100 μl感受態(tài)細(xì)胞中緩慢吸打混勻,，冰上放置30min。42℃熱激45~60sec,，冰浴5 min,。加500 μl SOC或LB培養(yǎng)基，37℃振蕩培養(yǎng)40~60min（200 rpm）,。將菌液均勻涂布在含有對應(yīng)抗生素的平板上,，倒置于37℃過夜培養(yǎng)。

注1：不同感受態(tài)細(xì)胞最后的克隆陽性率會有所差別,，推薦使用轉(zhuǎn)化效率>108 CFU/μg的感受態(tài)細(xì)胞,；

注2：菌落數(shù)取決于PCR產(chǎn)物與線性化載體的數(shù)量和純度；

注3：陽性對照平板通常生長大量白色單菌落，陰性對照平板只生長很少的菌落,。

7,、陽性克隆檢測

挑取單菌落至10 μl ddH2O中混勻，95℃裂解10 min 后,，取1 μl裂解液作為模板,，進(jìn)行菌落PCR鑒定，或?qū)尉浣臃N至抗性培養(yǎng)基中培養(yǎng)過夜后,，提取質(zhì)粒進(jìn)行酶切鑒定,。

注1：菌落 PCR 時建議至少使用一條通用引物，避免假陽性結(jié)果,；

注2：必要時可進(jìn)一步對陽性結(jié)果進(jìn)行測序鑒定,。

常見問題