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Glutathione Beads 4FF（GST填料）
產品貨號：G10510
產品說明
Glutathione Beads 4FF可以一步純化各種表達系統(tǒng)表達的gu胱甘肽-S-轉移酶,、gu胱甘肽依賴性蛋白和gu胱甘肽轉移酶的重組衍生物,。 Glutathione Beads 4FF是以高度交聯的4%瓊脂糖凝膠為基質,，通過12個原子的間隔臂,，用化學方法共價結合了還原型gu胱甘肽制作而 成。Glutathione Beads 4FF因其耐壓的基質,，可以在相對較高的流速下,，實現對目的蛋白的純化，更適合用于工業(yè)大規(guī)模蛋白的純化,。
表 1 Glutathione Beads 4FF 產品性能
項目 | 性能 |
基質 | 高度交聯的4%瓊脂糖凝膠 |
配體 | 通過12原子間隔臂偶連的gu胱甘肽 |
載量 | >10 mg GST-tagged protein(40 kDa) /ml 介質 |
微球粒徑 | 45-165 pm |
最大壓力 | 0.3 MPa, 3 bar |
pH穩(wěn)定范圍 | 3-12 |
儲存緩沖液 | 含20%乙醇的1xPBS |
儲存溫度 | 2-8 °C |
純化流程
1. 緩沖液的準備
緩沖液在使用前最好用0.22um或者0.45um濾膜過濾,。
平衡/洗雜液：140 mM NaCI, 2.7 mM KCI, 10 mM Na2HPO4, 1.8 mM KH2PO4, pH 7.4
洗脫液：用平衡液配制10mM還原型gu胱甘肽（現配現用）
注意：平衡液和洗脫液中可加入1-10 mM DTT
2. 樣品準備
樣品在上樣前建議離心或用0.22um或0.45um濾膜過濾，減少雜質,，提高蛋白純化效率和防止堵塞柱子,。
2.1細菌或酵母表達的蛋白
1）挑取單菌落到培養(yǎng)基中，根據載體使用說明,，加入相應濃度的誘導劑誘導相應的時間,。
2）表達結束后，將培養(yǎng)液轉移到離心杯中,，7000 rpm（7500xg）,離心15 min收集菌體,，然后按照菌體：平衡液=1： 10（W/V）加入平衡液，加入終濃度為1 mM的PMSF,。加入rong菌酶（工作濃度為0.2-0.4 mg/ml,如果表達的宿主細胞內含pLysS或pLysE,，可以不加rong菌酶，同時也可加入其他蛋白酶抑制劑,，
但不能影響目的蛋白與填料的結合）,。
3）將菌體沉淀懸浮起來，（如果菌液濃度高,，也可考慮加入10 ug/ml RNase A和5 ug/ml DNase I）,混勻,，放置于冰上，然后冰上超聲破碎細胞,，至菌液基本保持澄清,。
4）將澄清的破碎液轉移至離心管中，10000 rpm（15000xg）, 4°C離心20-30 min,。取上清,，置于冰上備用或-20°C保存。
2.2酵母,、昆蟲和哺乳細胞分泌表達可溶性蛋白
1） 將細胞培養(yǎng)液轉移至離心杯,，5000 rpm（3800xg）,離心10 min,收集菌體得上清，即可直接加入柱子使用,。
2） 對于大量體積的上清,，需加入硫酸銨沉淀濃縮后，蛋白還需用平衡液透析后才能加入柱子,。
3. 層析柱的裝填
3.1重力柱的裝填
1）取合適規(guī)格的重力層析柱,，裝入下墊片,，加入適量純水潤洗柱管和墊片，關閉下出口,。
2）將Glutathione Beads 4FF混合均勻,，用槍頭吸取適量漿液加入至重力柱中（介質實際體積占懸液的一半），打開下出口流干保護液,。
3）加入適量純水沖洗介質,，待柱管中液體重力流干后，關閉下出口,。
4）裝入潤洗后的上墊片,，確保墊片與填料之前沒有空隙，且保持水平,。
5）裝填好的重力柱可以直接加入平衡液進行平衡,，暫不使用時則加入保護液，2-8°C保存,。
3.2中壓層析柱的裝填
裝柱前根據層析柱直徑計算柱子底面積,，根據所需裝柱高度計算所需介質體積，公式如下：
V = 1.15πr2h (V：所需介質體積ml,；1.15：壓縮系數,；r：柱管半徑cm；h：裝填高度cm）
注意：所取懸液體積應為介質體積的兩倍,，因為介質體積只占懸液總體積的一半,，另一半為保護液。
1）用去離子水沖洗層析柱底篩板與接頭,，確保柱底篩板上無氣泡,，關閉柱底出口，并在柱底部留1-2 cm的去離子水,。
2）將介質懸浮起來,，小心的將漿液連續(xù)地倒入層析柱中。用玻璃棒沿著柱壁倒入漿液可減少氣泡的產生,。
3）如果使用儲液器,，應立即在層析柱和儲液器中加滿水，將進樣分配器放置于漿液表面,，連接至泵上,，避免在分配器或進樣管中產生氣泡。
4）打開層析柱底部出口,，開啟泵,，使其在設定的流速下進行。最初應讓緩沖液緩慢流過層析柱,，然后緩慢增加至最終流速,，這樣可避免液壓對所形成柱床的沖擊,，也可以避免柱床形成的不均勻。如果達不到推薦的壓力或流速,，可以用所使用泵的最大流速，這樣也可以得到一個很好的裝填效果,。（注意：在隨后的色譜程序中,，不要超過最大裝柱流速的75%）當柱床高度穩(wěn)定后，在最后的裝柱流速下至少再上3倍柱床體積的去離子水,。標上柱床高度,。
5）關閉泵，關閉層析柱出口,。
6）如果使用儲液器,，去除儲液器，將分配器置于層析柱中,。
7）將分配器推向柱子至標記的柱床高度處,。允許裝柱液進入分配器，鎖緊分配器接頭,。
8）將裝填好的層析柱連接至泵或色譜系統(tǒng)中,，開始平衡。如果需要可以重新調整分配器,。
4. 樣品純化流程
4.1孵育法純化
1）根據純化樣品量,，取適量Glutathione Beads 4FF加入離心管中，1000rpm離心1 min,吸棄上清,；也可加入重力柱中,，流干保護液。
2）向離心管中加入5倍介質體積的平衡液清洗介質,，1000rpm離心1 min,吸棄上清,；如使用重力柱，則直接在重力柱中清洗,，直接重力流干平衡液,；重復兩次以上。
3）加入樣品,，封閉離心管或重力柱管,，4°C振蕩孵育2-4h或者37°C孵育30 min-2h。
4）孵育結束后,，1000 rpm離心1 min,吸棄上清,，或過濾收集介質，上清保留作為流穿,，用于電泳鑒定,。
5）用5倍介質體積的洗雜液清洗介質,，1000 rpm離心1 min或重力柱管過濾，去除上清（注意不要吸到介質）,，重復3-5次,，中間建議更換新離心管。
6）加入3-5倍柱體積的洗脫液進行洗脫,，室溫孵育10-15 min, 1000 rpm離心1 min或重力柱管收集洗脫液,，可重復2-3次。
4.2重力柱法純化
1）將裝填好的Glutathione Beads 4FF重力柱用5倍柱體積平衡液進行平衡,，使填料處于與目的蛋白相同的緩沖液體系下,，重復2-3次。
2）將樣品加到平衡好的重力柱中,，樣品保留時間至少2 min,保證樣品和介質充分接觸,，收集流出液，可以反復上樣增加結合效率,。
3）用10-15倍柱體積的洗雜液進行洗雜,，去除非特異性吸附的雜蛋白，收集洗雜液,。
4）使用5-10倍柱體積的洗脫液洗脫,，分段收集，每一個柱體積收集一管,，分別檢測,，既可以保證所有結合的目的蛋白被洗脫，又可以得 到高純度和高濃度的蛋白,。
4.3中壓層析柱法純化
Glutathione Beads 4FF裝填好后,，可以用各種常規(guī)的中低壓色譜系統(tǒng)。
1）將泵管道中注滿去離子水,。去掉上塞子,，將層析柱連接至色譜系統(tǒng)中，打開下出口,，將預裝柱接到色譜系統(tǒng)中,，并旋緊。
2）用3-5倍柱體積的去離子水沖洗出儲存緩沖液,。
3）使用至少5倍柱床體積的平衡液平衡色譜柱,。
4）利用泵或樣品環(huán)上樣。
注:樣品的粘度增加使得即使上樣體積很少,，也會導致層析柱很大的反壓,。上樣量不要超過柱子的結合能力。大量的樣品體積也可能造成很大的反壓，使得進樣器更難使用,。
5）用洗雜液沖洗柱子,，直到紫外吸收達到一個穩(wěn)定的基線（一般至少10-15個柱體積）。
6）使用5-10倍柱體積的洗脫液洗脫,，收集洗脫液,，即目的蛋白組分。
上述步驟洗脫結束后,，用平衡液沖洗3倍柱體積,，然后用純水沖洗5倍柱體積，再用保護液沖洗2個柱體積,，然后將介質置于2-8°C保存。
5. SDS-PAGE 檢測
將使用純化產品得到的樣品（包括流出組分,、洗雜組分和洗脫組分）以及原始樣品使用SDS-PAGE檢測純化效果,。
6. 填料清洗
GST標簽蛋白純化產品可以重復使用而無需再生，但隨著非特異性結合的蛋白的增多和蛋白的聚集,，往往造成流速和結合載量性能下降, 這時需要對填料進行清洗,。
去除一些沉淀或變性物質，建議使用下面的方法
用2倍柱體積的6 M鹽酸胍溶液進行清洗,，然后立即用5倍柱體積的PBS, pH 7.4清洗,。
去除一些疏水性吸附造成的非特異性吸附物質
用3-4倍柱體積的70%乙醇或2倍柱體積的1% Triton X-100清洗，然后立即用5倍柱體積的PBS, pH 7.4清洗,。
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