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T4 DNA Ligase(Fast)
產品貨號：T5205-200U
儲存條件：-20℃
產品組成
組分 | 規(guī)格 |
T4 DNA Ligase(Fast)(5U/ul) | 40ul |
10×T4 DNA Ligase Buffer | 1ml |
50% PEG | 1ml |
注：1U=1 Weiss unit
產品簡介
T4 DNA Ligase(Fast)由攜帶T4噬菌體gene30的大腸桿菌產生,。該酶催化雙螺旋DNA或RNA之間的5'-磷酸基團和3'-羥基之間形成磷酸二酯鍵。該酶在雙鏈DNA,、RNA或者DNA/RNA復合物間可修復單鏈缺刻,，并且可以連接有粘性末端或者平末端的DNA片段,，但對于單鏈核酸無活性，主要用于限制性內切酶酶切產物DNA片段克隆,、基因定點突變與PCR產物克隆,、修復雙鏈DNA缺刻與線性DNA自環(huán)化。T4 DNA Ligase(Fast)需要ATP作為輔助因子,，在室溫下完成粘性末端連接反應僅需10分鐘,。
酶活單位定義
37℃條件下，1 Weiss unit的酶在20min內催化1nmol的[PPi]轉變?yōu)榛钚蕴课綉B(tài),。1 Weiss unit等同于約200個粘性末端連接反應單位（CEU）,，相當于在16℃條件下,，30min內連接50% HindIII消化后的λDNA片段,。
酶活檢測條件
酶活在如下反應混合物中進行測試：66mM Tris-HCl(pH7.6)，6.6mM MgCl,，0.066mM ATP,，10mM DTT，3.3μM[32PPi],。
質量控制
核酸量內控切酶制殘留測試
37℃條件下,，將200U的T4 DNA Ligase(Fast)與1ug的pUC19DNA中溫育4h，未檢測出共價閉合環(huán)狀DNA轉變?yōu)閹в腥笨痰腄NA,。
核酸外切酶殘留檢測
將酶液與雙鏈DNA底物在37℃溫育16h,，通過DNA電泳檢測雙鏈DNA底物無變化。
藍白斑測試
室溫條件下,，使用30U T4 DNA Ligase連接pUC57 DNA/HindIII,，pUC57 DNA/PstI或pUC57 DNA/SmaI消化產物1h，然后用E.coli XL1-Blue感受態(tài)細胞轉化連接產物,，檢測到少于1%的白斑,。
使用方法
1.DNA插入片段連接至載體DNA（粘性末端連接）
1）于冰上配制如下反應體系：
試劑 | 使用量 |
線性化載體DNA | 20~100ng |
插入片段DNA | 3:1~10:1（片段：載體摩爾比） |
10×T4 DNA Ligase Buffer | 2ul |
T4 DNA Ligase(Fast) | 1U(0.2ul) |
Nuclease-FreeWater | To 20ul |
2）充分混勻并瞬離，22℃溫育10min,；
3）取1~5ul的連接產物用于50ul化學感受態(tài)細胞的轉化,，或者取1~2ul用于50ul電轉感受態(tài)細胞的轉化。
注：如果連接反應產物用于電轉化,，應使用離心柱或者氯仿抽提清潔DNA代替熱失活步驟,。
2.DNA插入片段連接至載體DNA（平末端連接）
1）于冰上配制如下反應體系：
試劑 | 使用量 |
線性化載體DNA | 20~100ng |
插入片段DNA | 3:1~10:1（片段：載體摩爾比） |
10×T4 DNA Ligase Buffer | 2ul |
50% PEG | 2ul |
T4 DNA Ligase(Fast) | 5U(1ul) |
Nuclease-Free Water | To 20ul |
2）充分混勻并瞬離，22℃溫育1h,；
3）取1~5ul的連接產物用于50ul化學感受態(tài)細胞的轉化,，或者取1~2ul用于50ul電轉感受態(tài)細胞的轉化。
注：如果連接反應產物用于電轉化,，應使用離心柱或者氯仿抽提清潔DNA代替熱失活步驟,。
1. 線性DNA自環(huán)化
1）于冰上配制如下反應體系：
試劑 | 使用量 |
線性化DNA | 10~50ng |
10×T4 DNA Ligase Buffer | 5ul |
T4 DNA Ligase(Fast) | 5U(1ul) |
Nuclease-Free Water | To 50ul |
2）徹di混勻并瞬離,，22℃溫育10min；
3）取1~5ul的連接產物用于50ul化學感受態(tài)細胞的轉化,，或者取1~2ul用于50ul電轉感受態(tài)細胞的轉化,。
注：如果連接反應產物用于電轉化，應使用離心柱或者氯仿抽提清潔DNA代替熱失活步驟,。
2.接頭連接
雙鏈寡核苷酸接頭經常被用于在插入片段上產生粘性末端,。接頭通常包含限制酶識別位點，在連接后經酶切處理產生和克隆載體匹配的粘端,。有時候接頭已包含與克隆載體匹配的粘端,，此時無需在接頭連接完成后進行插入片段的進一步處理。
1）于冰上配制如下反應體系：
試劑 | 使用量 |
線性化DNA | 100~500ng |
磷酸化接頭 | 1~2ug |
10×T4 DNA Ligase Buffer | 2ul |
50% PEG | 2ul |
T4 DNA Ligase(Fast) | 2U(0.4ul) |
Nuclease-Free Water | To 20ul |
2）徹di混勻并瞬離,，22℃溫育10min,；
3）在65℃作用10min或者70℃作用5min，進行熱失活,。
注：添加1mM ATP的條件下,，T4 DNA Ligase(Fast)在LabFD™酶切緩沖液中具有100%活性。因此,，接頭連接反應時可以在LabFD™酶切緩沖液中進行,，以簡化“接頭連接-酶切"實驗流程。具體方法為：接頭連接反應完成后,，先失活T4 DNA Ligase,，然后向該體系中添加ATP至終濃度1mM，再在體系中加入適量的LabFD™快速內切酶,，最后使用最適酶切反應溫度進行溫育即可,。
注意事項
1）T4 DNA Ligase在濃度高于200mM的NaCl或KCl中會被強烈抑制；
2）連接反應液添加量不應該超過感受態(tài)細胞體積的10%,，不推薦體系中加入過量的T4 DNA Ligase,；
3）與T4 DNA Ligase結合的DNA可能會在瓊脂糖凝膠中出現(xiàn)帶移或彌散，為了避免此現(xiàn)象,，可以在上樣前對酶進行熱失活,，必要時加入適量的SDS；
4）聚乙二醇（PEG）能極大地提高平末端連接的連接效率,，PEG8000的推薦添加量是連接體系的5%（w/v）,；
5）電轉化效率可能通過對T4 DNA Ligase熱失活或者使用離心柱或者氯仿抽提純化DNA方式來提高；
6）轉化子數(shù)目可通過延長反應時間至1h而增加,。
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