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T4 DNA Ligase(Fast)

產(chǎn)品貨號：T5205-200U

儲存條件：-20℃

產(chǎn)品組成

注：1U=1 Weiss unit

產(chǎn)品簡介

T4 DNA Ligase(Fast)由攜帶T4噬菌體gene30的大腸桿菌產(chǎn)生,。該酶催化雙螺旋DNA或RNA之間的5'-磷酸基團和3'-羥基之間形成磷酸二酯鍵。該酶在雙鏈DNA,、RNA或者DNA/RNA復(fù)合物間可修復(fù)單鏈缺刻,，并且可以連接有粘性末端或者平末端的DNA片段，但對于單鏈核酸無活性,，主要用于限制性內(nèi)切酶酶切產(chǎn)物DNA片段克隆,、基因定點突變與PCR產(chǎn)物克隆、修復(fù)雙鏈DNA缺刻與線性DNA自環(huán)化,。T4 DNA Ligase(Fast)需要ATP作為輔助因子,，在室溫下完成粘性末端連接反應(yīng)僅需10分鐘。

酶活單位定義

37℃條件下,，1 Weiss unit的酶在20min內(nèi)催化1nmol的[PPi]轉(zhuǎn)變?yōu)榛钚蕴课綉B(tài),。1 Weiss unit等同于約200個粘性末端連接反應(yīng)單位（CEU），相當于在16℃條件下,，30min內(nèi)連接50% HindIII消化后的λDNA片段。

酶活檢測條件

酶活在如下反應(yīng)混合物中進行測試：66mM Tris-HCl(pH7.6),，6.6mM MgCl,，0.066mM ATP,，10mM DTT，3.3μM[32PPi],。

質(zhì)量控制

核酸量內(nèi)控切酶制殘留測試

37℃條件下,，將200U的T4 DNA Ligase(Fast)與1ug的pUC19DNA中溫育4h，未檢測出共價閉合環(huán)狀DNA轉(zhuǎn)變?yōu)閹в腥笨痰腄NA,。

核酸外切酶殘留檢測

將酶液與雙鏈DNA底物在37℃溫育16h,，通過DNA電泳檢測雙鏈DNA底物無變化。

藍白斑測試

室溫條件下,，使用30U T4 DNA Ligase連接pUC57 DNA/HindIII,，pUC57 DNA/PstI或pUC57 DNA/SmaI消化產(chǎn)物1h，然后用E.coli XL1-Blue感受態(tài)細胞轉(zhuǎn)化連接產(chǎn)物,，檢測到少于1%的白斑,。

使用方法

1.DNA插入片段連接至載體DNA（粘性末端連接）

1）于冰上配制如下反應(yīng)體系：

2）充分混勻并瞬離，22℃溫育10min,；

3）取1~5ul的連接產(chǎn)物用于50ul化學(xué)感受態(tài)細胞的轉(zhuǎn)化,，或者取1~2ul用于50ul電轉(zhuǎn)感受態(tài)細胞的轉(zhuǎn)化。

注：如果連接反應(yīng)產(chǎn)物用于電轉(zhuǎn)化,，應(yīng)使用離心柱或者氯仿抽提清潔DNA代替熱失活步驟,。

2.DNA插入片段連接至載體DNA（平末端連接）

1）于冰上配制如下反應(yīng)體系：

2）充分混勻并瞬離，22℃溫育1h,；

3）取1~5ul的連接產(chǎn)物用于50ul化學(xué)感受態(tài)細胞的轉(zhuǎn)化,，或者取1~2ul用于50ul電轉(zhuǎn)感受態(tài)細胞的轉(zhuǎn)化。

注：如果連接反應(yīng)產(chǎn)物用于電轉(zhuǎn)化,，應(yīng)使用離心柱或者氯仿抽提清潔DNA代替熱失活步驟,。

1. 線性DNA自環(huán)化

1）于冰上配制如下反應(yīng)體系：

2）徹di混勻并瞬離，22℃溫育10min,；

3）取1~5ul的連接產(chǎn)物用于50ul化學(xué)感受態(tài)細胞的轉(zhuǎn)化,，或者取1~2ul用于50ul電轉(zhuǎn)感受態(tài)細胞的轉(zhuǎn)化。

注：如果連接反應(yīng)產(chǎn)物用于電轉(zhuǎn)化,，應(yīng)使用離心柱或者氯仿抽提清潔DNA代替熱失活步驟,。

2.接頭連接

雙鏈寡核苷酸接頭經(jīng)常被用于在插入片段上產(chǎn)生粘性末端。接頭通常包含限制酶識別位點,，在連接后經(jīng)酶切處理產(chǎn)生和克隆載體匹配的粘端,。有時候接頭已包含與克隆載體匹配的粘端，此時無需在接頭連接完成后進行插入片段的進一步處理,。

1）于冰上配制如下反應(yīng)體系：

2）徹di混勻并瞬離,，22℃溫育10min,；

3）在65℃作用10min或者70℃作用5min,，進行熱失活,。

注：添加1mM ATP的條件下，T4 DNA Ligase(Fast)在LabFD™酶切緩沖液中具有100%活性。因此，接頭連接反應(yīng)時可以在LabFD™酶切緩沖液中進行，以簡化“接頭連接-酶切"實驗流程,。具體方法為：接頭連接反應(yīng)完成后，先失活T4 DNA Ligase,，然后向該體系中添加ATP至終濃度1mM,，再在體系中加入適量的LabFD™快速內(nèi)切酶，最后使用最適酶切反應(yīng)溫度進行溫育即可,。

注意事項

1）T4 DNA Ligase在濃度高于200mM的NaCl或KCl中會被強烈抑制,；

2）連接反應(yīng)液添加量不應(yīng)該超過感受態(tài)細胞體積的10%，不推薦體系中加入過量的T4 DNA Ligase,；

3）與T4 DNA Ligase結(jié)合的DNA可能會在瓊脂糖凝膠中出現(xiàn)帶移或彌散,，為了避免此現(xiàn)象，可以在上樣前對酶進行熱失活,，必要時加入適量的SDS,；

4）聚乙二醇（PEG）能極大地提高平末端連接的連接效率，PEG8000的推薦添加量是連接體系的5%（w/v）,；

5）電轉(zhuǎn)化效率可能通過對T4 DNA Ligase熱失活或者使用離心柱或者氯仿抽提純化DNA方式來提高,；

6）轉(zhuǎn)化子數(shù)目可通過延長反應(yīng)時間至1h而增加。