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DYKDDDDK-Nanoab-Agarose

貨號：FNA-25-500   FNA-50-1000

保存條件：4℃一年；-80℃長期保存,，避免反復(fù)凍融

產(chǎn)品描述

偶聯(lián)anti-DYKDDDDK-tag納米抗體的瓊脂糖珠子用于免疫沉淀DYKDDDDK-tag (DYKDDDDK)融合蛋白,。

產(chǎn)品優(yōu)勢

l 沒有普通抗體的輕鏈和重鏈；

l 即用型,，節(jié)約時間,；

l 高親和力，高載量;

應(yīng)用范圍

可用于免疫沉淀（IP）/免疫共沉淀（CoIP）,、染色質(zhì)免疫沉淀（ChIP）/RNA結(jié)合蛋白免疫沉淀（RIP）,、酶活性測定、質(zhì)譜分析等,；

特異性

特異性結(jié)合DYKDDDDK-tag,。

產(chǎn)品特性

存儲緩沖液：PBS(含有20%乙醇)。

保存條件：可在4℃保存1年(確保wan全密封),，或在-80℃長期保存,，避免反復(fù)凍融。

實驗步驟：

收集細(xì)胞
每個免疫沉淀反應(yīng)大約使用 10⁶-10⁷ 個表達(dá)DYKDDDDK-tag融合蛋白的細(xì)胞,，可根據(jù)DYKDDDDK-tag融合蛋白表達(dá)量適當(dāng)調(diào)整細(xì)胞數(shù),。吸出培養(yǎng)基，向培養(yǎng)皿中加入預(yù)冷的1×PBS,，漂洗2次,，利用細(xì)胞刮或yi酶消化收集貼壁細(xì)胞，細(xì)胞轉(zhuǎn)移到離心管,，500g離心3min并丟棄上清液,。

植物組織裂解處理：

取適量植物組織樣本（葉片等）放置于冷凍液氮中，之后將冷凍后得植物組織樣本放于研缽進(jìn)行研磨，盡可能充分研磨破壞其細(xì)胞壁,。加入500-1000ul RIPA 裂解液（已加蛋白酶抑制劑 PMSF 等）進(jìn)行裂解,，為了提高裂解效率,，加入 200ul 玻璃粉充分震蕩 30min,，裂解完成后 12000 rpm，離心 30min,，吸取上清 置新的離心管中,，棄去沉淀。

細(xì)胞裂解
1．在裂解緩沖液中加入蛋白酶抑制劑,，用500μl預(yù)冷的裂解緩沖液重懸細(xì)胞,。

2．置于冰上30分鐘，可每10分鐘充分吹打一次,。
3．4℃,，20,000g離心15分鐘，將裂解產(chǎn)物（上清）轉(zhuǎn)移到一個新的預(yù)冷管中,，丟棄沉淀,。

注意：此時細(xì)胞裂解產(chǎn)物可長期保存于-80℃。

結(jié)合蛋白
4．將20μl平衡好的DYKDDDDK-Nanoab-Agarose加入到細(xì)胞裂解產(chǎn)物中（可在細(xì)胞裂解產(chǎn)物中直接加入20μl該產(chǎn)品）,，于4℃旋轉(zhuǎn)混合結(jié)合1小時,。根據(jù)實驗需要可調(diào)整結(jié)合時間。如果需要,，留存50μl的裂解產(chǎn)物進(jìn)行免疫印跡分析,。

5．4℃，2,500g離心30秒,，丟棄上清液,。如果需要，留存50μl上清液進(jìn)行免疫印跡分析,。

清洗珠子
6．用500μl預(yù)冷的裂解緩沖液中重懸5中的DYKDDDDK-Nanoab-Agarose，4℃,，2,500g條件下離心30秒,，丟棄上清液并重復(fù)洗滌3次。盡量減少清洗時間,。

洗脫蛋白
方法一：
7. 加入20μl 2×SDS-sample buffer重懸DYKDDDDK-Nanoab-Agarose,。95℃，加熱10min充分變性,，2,500g離心30秒收集上清,，收集的產(chǎn)物可進(jìn)行SDS-PAGE及免疫印跡分析。
方法二：
8. 替代步驟7的可選步驟：加入50μl 0.2M pH2.5的gan氨酸洗脫結(jié)合的蛋白,，孵育時間30秒,，期間不斷混勻,，2,500g離心30秒收集上清，立即加入5μl 1.0M Tris（pH10.4）以中和酸性的gan氨酸,。如果洗脫的蛋白含量少,，可嘗試用2×DYKDDDDK-tag進(jìn)行親和純化。

注意：為了提高洗脫效率可以重復(fù)這一步,。

可選方案
方案一：
如需進(jìn)行DYKDDDDK融合酶的活性檢測,，無需洗脫，可以直接檢測,。
方案二：
如需進(jìn)行染色質(zhì)免疫沉淀（ChIP）實驗，主要用于含有DYKDDDDK融合蛋白的蛋白質(zhì)/DNA相互作用的實驗,。染色質(zhì)免疫沉淀一般包括細(xì)胞固定,，染色質(zhì)斷裂，染色質(zhì)免疫沉淀,，聯(lián)反應(yīng)的逆轉(zhuǎn),，DNA的純化以及DNA的鑒定。其中前期細(xì)胞固定,，染色質(zhì)斷裂不變,；然后接著直接進(jìn)入說明書的第4步，加入細(xì)胞裂解產(chǎn)物后,，DNA-蛋白質(zhì)復(fù)合物結(jié)合到DYKDDDDK-Nanoab-Agarose上,；
進(jìn)入第5和6步，分離得到復(fù)合物,；進(jìn)入第8步,，得到洗脫的復(fù)合物；后期交聯(lián)反應(yīng)的逆轉(zhuǎn),，DNA的純化及DNA的鑒定等同于普通的ChIP實驗,。RNA結(jié)合蛋白免疫沉淀（RIP）實驗步驟同上。
方案三：
DYKDDDDK-Nanoab-Agarose 不僅可以用于在體內(nèi)外檢測和驗證蛋白質(zhì)之間的相互作用,，也可以結(jié)合質(zhì)譜分析篩選與已知蛋白相互作用的未知蛋白,。其操作步驟同免疫沉淀法，得到洗脫的復(fù)合物后，然后進(jìn)行SDS–PAGE分析,，用考馬斯亮藍(lán)或者銀染的方法染色后,，切下未知蛋白的條帶，用質(zhì)譜技術(shù)鑒定未知蛋白,。