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MYC-Nanoab-Magnetic Beads
貨號：MNM-25-1000
儲存條件：可在4℃保存1年(確保*密封),，避免離心,，干燥和凍融。
產品描述
偶聯anti-Myc-tag納米抗體的磁性納米微球用于免疫沉淀Myc-tag (EQKLISEEDL)融合蛋白,。
產品優(yōu)勢
沒有普通抗體的輕鏈和重鏈,，背景干凈；
即用型,，節(jié)約時間,；
高親和力，高載量,。
應用范圍
可用于免疫沉淀（IP）/免疫共沉淀（CoIP）,、染色質免疫沉淀（ChIP）/RNA結合蛋白免疫沉淀（RIP）、酶活性測定,、質譜分析等,。
特異性
特異性結合位于融合蛋白N-端、C-端及內部的Myc-tag,。不結合內源性c-Myc,。
產品特性
存儲緩沖液：PBS(含有20%乙醇),。
保存條件：可在4℃保存1年(確保*密封)，避免離心,，干燥和凍融,。
實驗原理
實驗步驟
收集細胞
每個免疫沉淀反應大約使用 106-107 個表達Myc-tag融合蛋白的細胞，可根據Myc-tag融合蛋白表達量適當調整細胞數,。
吸出培養(yǎng)基,，向培養(yǎng)皿中加入預冷的1×PBS，漂洗2次,，利用細胞刮或胰酶消化收集貼壁細胞,，細胞轉移到離心管，500g離心3分鐘并丟棄上清液,。
植物組織裂解處理：
取適量植物組織樣本（葉片等）放置于冷凍液氮中,，之后將冷凍后得植物組織樣本放于研缽進行研磨，盡可能充分研磨破壞其細胞壁,。加入500-1000ul RIPA 裂解液（已加蛋白酶抑制劑 PMSF 等）進行裂解,，為了提高裂解效率，加入 200ul 玻璃粉充分震蕩 30min,，裂解完成后 12000 rpm,，離心 30min，吸取上清 置新的離心管中,，棄去沉淀,。
細胞裂解
1.在裂解緩沖液中加入蛋白酶抑制劑,，用500μl預冷的裂解緩沖液重懸細胞,。
2.置于冰上30分鐘，可每10分鐘充分吹打一次,。
3.4℃,，20,000g離心15分鐘，將裂解產物（上清）轉移到一個新的預冷管中,，丟棄沉淀,。注意：此時細胞裂解產物可長期保存于-80℃。
平衡珠子
4.充分混勻Myc-Nanoab-Magnetic Beads,，吸取40μl該產品到500μl預冷的裂解緩沖液中,，在磁力架上分離磁珠直到上清變成清亮的狀態(tài)，丟棄上清液,。（此步驟可選）
結合蛋白
5.將平衡好的Myc-Nanoab-Magnetic Beads加入到細胞裂解產物中（如果未做第4步,，可在細胞裂解產物中直接加入40μl該產品），于4℃旋轉混合結合1小時,。根據實驗需要可調整結合時間,。如果需要,，留存50μl的裂解產物進行免疫印跡分析。
6.在磁力架上分離磁珠直到上清變成清亮的狀態(tài),，丟棄上清液,。如果需要，留存50μl上清液進行免疫印跡分析,。
清洗珠子
7.用500μl預冷的裂解緩沖液中重懸6中的Myc-Nanoab-Magnetic Beads,，在磁力架上分離磁珠直到上清變成清亮的狀態(tài)，丟棄上清液并重復清洗3次,。盡量減少清洗時間,。
洗脫蛋白
方法一：
8.加入20μl 2×SDS-sample buffer重懸Myc-Nanoab-Magnetic Beads。95℃,，加熱10min充分變性,，在磁力架上進行分離，收集的產物可進行SDS-PAGE及免疫印跡分析,。
方法二：
9.加入50μl 0.2 M pH2.5的甘氨酸洗脫結合的蛋白,，孵育時間30秒，期間不斷混勻,，在磁力架上進行分離并收集上清,，立即加入5μl 1.0 M Tris（pH10.4）以中和酸性的甘氨酸。注意：為了提高洗脫效率可以重復這一步,。
方法三：
10.加入40µM Myc-peptide進行洗脫,。
可選實驗方案
方案一：
如需進行Myc融合酶的活性檢測，無需洗脫,，可以直接檢測,。
方案二：
如需進行染色質免疫沉淀（ChIP）實驗，主要用于含有Myc融合蛋白的蛋白質/DNA相互作用的實驗,。染色質免疫沉淀一般包括細胞固定,，染色質斷裂，染色質免疫沉淀,，聯反應的逆轉,，DNA的純化以及DNA的鑒定。其中前期細胞固定,，染色質斷裂不變,；然后接著直接進入說明書的第5步，加入細胞裂解產物后,，DNA-蛋白質復合物結合到Myc-Nanoab-Magnetic Beads上,；
進入第6和7步，分離得到復合物,；進入第9步,，得到洗脫的復合物,；后期交聯反應的逆轉，DNA的純化及DNA的鑒定等同于普通的ChIP實驗,。RNA結合蛋白免疫沉淀（RIP）實驗步驟同上,。
方案三：
Myc-Nanoab-Magnetic Beads不僅可以用于在體內外檢測和驗證蛋白質之間的相互作用，也可以結合質譜分析篩選與已知蛋白相互作用的未知蛋白,。其操作步驟同免疫沉淀法,，得到洗脫的復合物后，然后進行SDS–PAGE分析,，用考馬斯亮藍或者銀染的方法染色后,，切下未知蛋白的條帶，用質譜技術鑒定未知蛋白,。
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