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Flag-Magnetic 免疫沉淀試劑盒（PROCAP Flag-Magnetic IP/CoIP KIT）

貨號：PFM025

存儲條件：-20°C保存,。Flag-Magnetic beads經(jīng)常使用可在4℃保存，在-20或-80℃長期保存,，避免反復(fù)凍融,。

試劑盒組分：

產(chǎn)品簡介：

   LABLEAD的免疫沉淀beads是基于基因工程改造的納米抗體開發(fā)的,；納米抗體由傳統(tǒng)抗體的重鏈可變區(qū)（VHH）組成,，具有分子量小、親和力高,、特異性強(qiáng),，且耐酸堿高溫環(huán)境等特點(diǎn)；基于納米抗體的優(yōu)點(diǎn),，LABLEAD的免疫沉淀beads避免了免疫沉淀結(jié)果出現(xiàn)輕重鏈污染的現(xiàn)象,，并且節(jié)省實(shí)驗(yàn)時間。

實(shí)驗(yàn)步驟：

提示：盡量在4℃進(jìn)行操作,，洗脫蛋白方法一除外,。

1.植物組織裂解處理：

取適量植物組織樣本（葉片等）放置于冷凍液氮中,，之后將冷凍后得植物組織樣本放于研缽進(jìn)行研磨,，盡可能充分研磨破壞其細(xì)胞壁。加入500-1000ul 裂解液A或裂解液B（需加入PMSF溶液）進(jìn)行裂解,，為了提高裂解效率,，可加入 200ul 玻璃粉按照600-800g離心力充分震蕩 30min，裂解完成后 12000 rpm,，離心30min,，吸取上清置于新的離心管中，棄去沉淀,。（進(jìn)行第3步）

2. 動物細(xì)胞裂解

2.1 收集細(xì)胞：

根據(jù)實(shí)驗(yàn)要求收集適量的細(xì)胞,，通常每個免疫沉淀反應(yīng)大約使用 10⁶-10⁷ 個細(xì)胞。

2.2 裂解細(xì)胞：

根據(jù)實(shí)驗(yàn)要求選擇使用溶液A或溶液B裂解細(xì)胞,。在溶液A或溶液B中加入蛋白酶抑制劑,，用500μl預(yù)冷的溶液A或溶液B重懸細(xì)胞；置于冰上30分鐘，可每10分鐘充分吹打一次,；4℃,，20,000g離心15分鐘，將裂解產(chǎn)物（上清）轉(zhuǎn)移到一個新的預(yù)冷管中,，丟棄沉淀,。

3. 平衡珠子：

振蕩充分混勻珠子，吸取40μl Flag-Nanoab-Magnetic beads到500μl預(yù)冷的溶液A或溶液B中,，4℃,，在磁力架上分離磁珠直到上清變成清亮的狀態(tài)，丟棄上清液,。（此步驟可選）

3. 結(jié)合蛋白：將平衡好的beads（如果未做第 4 步,，可在細(xì)胞裂解產(chǎn)物中直接加入40μl slurry）加入到細(xì)胞裂解產(chǎn)物中，于4℃旋轉(zhuǎn)混合結(jié)合30min-1h,。在磁力架上分離磁珠直到上清變成清亮的狀態(tài),，丟棄上清液。

5. 清洗珠子：

根據(jù)實(shí)驗(yàn)要求選擇使用溶液C或溶液D清洗beads,。4℃,，利用磁性分離，丟棄上清液,。

用500μl預(yù)冷的溶液C或溶液D重懸beads,，4℃，在磁力架上分離磁珠直到上清變成清亮的狀態(tài),，丟棄上清液并重復(fù)洗滌 2 次,。（可選：在第二次洗滌的步驟中增加鹽濃度到 500 mM）。

6. 洗脫蛋白

方法一：

加入20μl 2×SDS-sample buffer重懸beads,。95℃,，加熱10min充分變性，F(xiàn)lag-Nanoab-Magnetic Beads 可在磁力架上進(jìn)行分離,，收集的產(chǎn)物可進(jìn)行SDS-PAGE及免疫印跡分析,。

方法二：

加入溶液E洗脫結(jié)合的蛋白，孵育時間30秒,，期間不斷混勻,，利用磁性分離收集上清，為了中和酸性的甘氨酸,，立即加入5μl 1.0 M Tris（pH10.4）,。

注意：為了提高洗脫效率可以重復(fù)這一步。收集的產(chǎn)物可進(jìn)行SDS-PAGE及免疫印跡分析,。

注意事項(xiàng)：

1,、關(guān)于裂解液與裂解液的選擇：

裂解液A為溫和裂解液，裂解液B為強(qiáng)裂解液，請根據(jù)自己實(shí)驗(yàn)樣本選擇相應(yīng)的裂解液,，如：若為胞質(zhì)蛋白可選裂解液A或者A與B混合使用,，若為核蛋白則可選擇裂解液B。

漂洗液C和漂洗液D的選擇：（裂解液D為高鹽溶液,，可能會破壞蛋白間較弱的相互作用）,，若兩個蛋白相互作用強(qiáng)，同時還想減少非特異性結(jié)合,，可選D,；若兩個蛋白相互作用弱的優(yōu)先C。

2,、盡量避免過多的反復(fù)凍融,。可以適當(dāng)分裝后使用,。

3,、本產(chǎn)品僅供科研使用，不得用于臨床診斷或治療,，不得用于食品或藥品,。

4、為了您的安全和健康,，請穿實(shí)驗(yàn)服并戴一次性手套操作,。