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RFP-Agarose 免疫沉淀試劑盒（PROCAP RFP-Agarose IP/CoIP KIT）

貨號(hào)：PRA025

存儲(chǔ)條件：-20°C保存，RFP-Agarose beads經(jīng)常使用可在4℃保存,，-80或-20℃長(zhǎng)期保存,，避免反復(fù)凍融。

試劑盒組分：

產(chǎn)品簡(jiǎn)介：

   LABLEAD的免疫沉淀beads是基于基因工程改造的納米抗體開(kāi)發(fā)的,；納米抗體由傳統(tǒng)抗體的重鏈可變區(qū)（VHH）組成,，具有分子量小、親和力高、特異性強(qiáng),，且耐酸堿高溫環(huán)境等特點(diǎn),；基于納米抗體的優(yōu)點(diǎn)，LABLEAD的免疫沉淀beads避免了免疫沉淀結(jié)果出現(xiàn)輕重鏈污染的現(xiàn)象,，并且節(jié)省實(shí)驗(yàn)時(shí)間,。

實(shí)驗(yàn)步驟：

提示：盡量在4℃進(jìn)行操作，洗脫蛋白方法一除外,。

1.植物組織裂解處理：

取適量植物組織樣本（葉片等）放置于冷凍液氮中,，之后將冷凍后得植物組織樣本放于研缽進(jìn)行研磨，盡可能充分研磨破壞其細(xì)胞壁,。加入500-1000ul 裂解液A或裂解液B（需加入PMSF溶液）進(jìn)行裂解,，為了提高裂解效率，可加入 200ul 玻璃粉按照600-800g離心力充分震蕩 30min,，裂解完成后 12000 rpm,，離心 30min，吸取上清置于新的離心管中,，棄去沉淀,。（進(jìn)行第3步）

2. 動(dòng)物細(xì)胞

2.1 收集細(xì)胞：

根據(jù)實(shí)驗(yàn)要求收集適量的細(xì)胞，通常每個(gè)免疫沉淀反應(yīng)大約使用 10⁶-10⁷ 個(gè)細(xì)胞,。

2.2 裂解細(xì)胞：

根據(jù)實(shí)驗(yàn)要求選擇使用溶液A或溶液B裂解細(xì)胞,。在溶液A或溶液B中加入蛋白酶抑制劑，用500μl預(yù)冷的溶液A或溶液B重懸細(xì)胞,；置于冰上30分鐘,，可每10分鐘充分吹打一次；細(xì)胞裂解物4℃,，20,000g離心15分鐘,，將裂解產(chǎn)物（上清）轉(zhuǎn)移到一個(gè)新的預(yù)冷管中，丟棄沉淀,。

3. 平衡珠子：

振蕩充分混勻珠子,， 吸取20μl RFP-Nanoab-Agarose beads到500μl預(yù)冷的溶液A或溶液B中，4℃,，2,500g離心2分鐘,，丟棄上清液。

4. 結(jié)合蛋白：

將平衡好的beads加入到細(xì)胞裂解產(chǎn)物中,，于4℃旋轉(zhuǎn)混合結(jié)合30min-1h,。

5. 清洗珠子：

根據(jù)實(shí)驗(yàn)要求選擇使用溶液C或溶液D清洗beads。4℃,，2,500g 離心2分鐘,，丟棄上清液。用500μl預(yù)冷的溶液C或溶液D重懸beads，4℃,，2,500g條件下離心2分鐘,，丟棄上清液并重復(fù)洗滌3次。

6. 洗脫蛋白

方法一：

加入20μl 2×SDS-sample buffer重懸beads,。95℃，加熱10min充分變性,，2,500g離心2分鐘收集上清,，收集的產(chǎn)物可進(jìn)行SDS-PAGE及免疫印跡分析。

方法二：

加入溶液E洗脫結(jié)合的蛋白,，孵育時(shí)間30秒,，期間不斷混勻，2,500g離心2分鐘收集上清,，為了中和酸性的甘氨酸,，立即加入5μl 1.0 M Tris（pH10.4）。

注意：為了提高洗脫效率可以重復(fù)這一步,。收集的產(chǎn)物可進(jìn)行SDS-PAGE及免疫印跡分析,。

注意事項(xiàng)：

1、關(guān)于裂解液與裂解液的選擇：

裂解液A為溫和裂解液,，裂解液B為強(qiáng)裂解液,，請(qǐng)根據(jù)自己實(shí)驗(yàn)樣本選擇相應(yīng)的裂解液，如：若為胞質(zhì)蛋白可選裂解液A或者A與B混合使用,，若為核蛋白則可選擇裂解液B,。

漂洗液C和漂洗液D的選擇：（裂解液D為高鹽溶液，可能會(huì)破壞蛋白間較弱的相互作用）,，若兩個(gè)蛋白相互作用強(qiáng),，同時(shí)還想減少非特異性結(jié)合，可選D,；若兩個(gè)蛋白相互作用弱的優(yōu)先C,。

2、盡量避免過(guò)多的反復(fù)凍融,?？梢赃m當(dāng)分裝后使用。

3,、本產(chǎn)品僅供科研使用,，不得用于臨床診斷或治療，不得用于食品或藥品,。

4,、為了您的安全和健康，請(qǐng)穿實(shí)驗(yàn)服并戴一次性手套操作。