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Taq SYBR® Green qPCR Premix (通用型)

產(chǎn)品貨號：R0202

儲存條件：長期保存請于 -20℃避光保存,，Mix 融解后可在 4℃避光條件下穩(wěn)定存放一個月，盡量避免反復(fù)凍融,。

產(chǎn)品簡介

Taq SYBR® Green qPCR Premix 是 SYBR® Green I 嵌合染料法專用qPCR試劑,，為2×預(yù)混液,，包含除引物和DNA樣品以外的所有qPCR組分，可減少操作步驟,，縮短加樣時間,，降低污染幾率。其核心組分是經(jīng)抗體修飾的熱啟動Taq DNA聚合酶,，配合精心優(yōu)化的Buffer體系以及PCR反應(yīng)促進因子,，使產(chǎn)品具有特異性強、擴增效率高等特點,，有效抑制非特異性擴增,，可對寬廣濃度范圍的模板進行準(zhǔn)確定量，獲得穩(wěn)定可靠的qPCR結(jié)果,。

使用方法

1.適配機型

全機型通用

2.使用注意

① 因Mix中預(yù)混有染料,，其保存或反應(yīng)體系配制過程應(yīng)避免強光照射；

② 使用前上下顛倒輕輕混勻Mix,，請勿渦旋振蕩混勻,，避免產(chǎn)生過多氣泡。

3.建議的qPCR反應(yīng)體系

a.調(diào)通推薦的引物終濃度為0.2uM,，反應(yīng)效果不佳時可在0.1~1uM范圍內(nèi)進行調(diào)整;

b.推過薦模板加樣量的為1~2ul,，如模板類型為未稀釋cDNA原液，模板添加量不應(yīng)超過總反應(yīng)體系的10%,，不同種類DNA模板中含有的靶基因拷貝數(shù)目不同,，必要時可進行梯度稀釋，以確定必要的DNA模板添加量,。

4.qPCR 反應(yīng)程序（可根據(jù)機型適當(dāng)調(diào)整）

兩步法：

三步法：

a.根據(jù)引物的Tm值進行退火&延伸（退火）溫度的設(shè)定,；若擴增片段在200bp以內(nèi)，退火&延伸（延伸）時間可以設(shè)置為15sec;此外,，退火&延伸（延伸）時間的設(shè)置還需根據(jù)您使用的qPCR儀所需的最短數(shù)據(jù)采集時間自行調(diào)整,；

b.不同 qPCR 儀的熔解曲線采集程序有差別，一般可使用儀器默認(rèn)的熔解曲線采集程序,。

5.實驗優(yōu)化

若使用默認(rèn)反應(yīng)條件反應(yīng)性能不佳時,，則需要進行反應(yīng)條件的優(yōu)化，可以從引物濃度以及擴增程序兩個方面進行：

① 引物濃度調(diào)整

當(dāng)引物終濃度在0.1~1.0uM范圍之間變化時,，引物濃度越低,，擴增特異性越高，但擴增效率會有所下降,。

② 擴增程序優(yōu)化

需提高擴增特異性,，可使用兩步法程序或提高退火溫度；需提高擴增效率,，可使用三步法程序或延長延伸時間,。

6.引物設(shè)計原則

① 擴增產(chǎn)物長度建議控制在80~200bp,；

② 引物長度為18~25bp；

③ 正向引物和反向引物的Tm值相差不超過 1℃為佳,，Tm值控制在58~62℃為佳,；

④ 引物的GC含量控制在 40%~60% 之間；

⑤ 引物A,、G,、C、T整體分布盡量要均勻,，避開T/C或者A/G的連續(xù)結(jié)構(gòu)（特別是3'端）,；

⑥ 引物3'端zuihou一個堿基zuihao為G或者C；

⑦ 避開引物內(nèi)部或者兩條引物之間的互補序列,；

⑧ 使用NCBI BLAST功能檢索確認(rèn)引物的特異性,。