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產品貨號：D0204P
儲存條件：-20℃
產品組分
組分/規(guī)格 | 10T | 25T | 50T |
DNA Assembly Mix PLUS | 50μl | 125μl | 250μl |
pUC19 Control Plasmid, Linearized (Ampr, 40 ng/μl) | 5μl | 5μl | 5μl |
500 bp Control Fragment (20 ng/μl) | 5μl | 5μl | 5μl |
產品簡介
基于重組原理的無縫克隆技術,，作為新一代的克隆方法,，不依賴繁瑣的酶切、連接步驟,，也不需要末端補平等操作,，依據(jù)DNA片段與線性化載體末端的15~25nt同源序列的重組，可將插入片段克隆至任意線性載體的任意位點,，載體自連背景極低,，是一種簡單、快速,、高效的DNA定向克隆技術,。
DNA Assembly MixPLUS無縫克隆試劑盒最kuai僅需5分鐘即可完成單片段重組,，且陽性率高于95%。Mix中添加的輔助因子,，有效提高克隆陽性率,；經優(yōu)化的反應體系，能夠一定程度上耐受未純化PCR產物中含有的雜質,。升級版的無縫克隆試劑盒具有更高的陽性率,、更好的兼容性。
使用簡單 —— 兼容PCR與酶切體系,，省去繁瑣的純化步驟
超高效率 —— 可以穩(wěn)定支持5-6片段在同一克隆體系
穩(wěn)定可靠 —— 37℃放置一周或凍融30次,，無明顯下降
實驗步驟
1、實驗流程概要
2,、線性化克隆載體制備
選擇合適的克隆位點,，對載體進行線性化，載體的線性化可以通過酶切或反向 PCR 擴增完成,。
① 酶切制備
推薦使用LabFD™快速內切酶進行雙酶切,，使載體線性化*，以降低轉化背景(假陽性克隆),；若使用單酶切進行線性化,，可以適當延長酶切時間以減少環(huán)狀質粒殘留。
注1：經雙酶切進行線性化的載體無需去磷酸化,，經單酶切則需要去磷酸化,；
注2：酶切完成后，應將快速內切酶失活或對目的產物純化后再用于重組反應,。
② 反向 PCR 擴增制備
為減少擴增突變的引入,，推薦使用高保真PCR Mix進行擴增。推薦使用預線性化質粒作為模板,，以減少環(huán)狀質粒模板殘留對克隆陽性率的影響,。
3、插入片段PCR引物設計
PCR引物的5' 端必須包含與其相鄰片段（插入片段或載體）末端同源的15~25 nt（推薦18nt）序列,。假如載體為粘性末端,，且3'端突出，則引物設計必須包含突出部分,；若5'端突出,，則引物設計可以包含突出部分，也可以不包含,。
插入片段正向擴增引物：
5'—上游載體末端同源序列+酶切位點（可選）+ 基因特異性正向擴增序列— 3'
插入片段反向擴增引物：
3'—基因特異性反向擴增序列+酶切位點（可選）+下游載體末端同源序列—5'
注1：盡量選擇無重復序列且GC含量均勻的區(qū)域進行克隆,，當載體克隆位點上下游25 nt區(qū)域內GC含量為40%~60%時，重組效率zuigao,；
注2：本試劑盒所提供的 pUC 19 載體（Ampr）連接端序列如下：
4,、插入片段的 PCR 擴增
推薦使用高保真PCR Mix進行擴增，以減少擴增突變的引入,。建議使用純化后的PCR產物進行無縫克隆反應,，若PCR產物經瓊脂糖凝膠電泳鑒定為特異性擴增產物,，可直接使用,，但加樣體積不應超過總反應體積的20%。
5,、重組反應
①于冰水浴中配置以下反應體系：
組分 | 反應體系 | 陰性對照 | 陽性對照（如有必要） |
DNA Assembly Mix | 5μl | 5μl | 5μl |
線性化載體（ng） | 50~200ng | 50~100ng | pUC19 Control Plasmid,Linearized, 1 μl |
插入片段 | 10~200 ng | - | 500 bp Control, Fragment, 1 μl |
ddH2O | To 10 μl | ||
a.the best載體用量(ng)=0.02×載體堿基對數(shù),，即0.03pmol。
b.插入單片段,，the best片段用量（ng）= 0.04×片段堿基對數(shù),；
插入多片段，每片段the best用量（ng）= 0.02×片段堿基對數(shù),。
注1：若插入單片段的長度大于載體,，則應互換載體與插入片段用量,；
注2：若插入片段的長度小于200 bp,，則插入片段應使用5倍載體用量；
注3：若按上述公式計算得到的用量超過最di/最gao值,，則建議直接按最di/最gao用量使用,；
注4：載體片段過長、插入片段過長克隆陽性率均會降低,。
重組反應體系配制完成后,，用移液槍輕輕吸打混勻各組分，避免產生氣泡,，切勿渦旋,。
② 將反應體系置于50℃，反應5~60min,。
注1：推薦使用 PCR 儀等溫控比較精準的儀器進行反應,，反應時間不足或太長克隆效率均會降低；
注2：插入1-2個片段時,，推薦反應時間5-15min,，插入3-5個片段時,，推薦反應時間15-30min；
注3：當載體骨架在 10 kb 以上或插入片段在4 kb以上時,，建議延長反應時間到30-60min
注4：50℃反應完成后,，建議進行瞬時離心，將反應液收集至管底,。
③ 將反應液離心管置于冰上冷卻,，之后進行轉化或者儲存于-20℃。
注1：-20℃儲存的重組產物,，建議在1周內使用,。
6、重組產物轉化
取5~10μl反應液,，加入到100 μl感受態(tài)細胞中緩慢吸打混勻,，冰上放置30min。42℃熱激45~60sec,，冰浴5 min,。加500 μl SOC或LB培養(yǎng)基，37℃振蕩培養(yǎng)40~60min（200 rpm）,。將菌液均勻涂布在含有對應抗生素的平板上,，倒置于37℃過夜培養(yǎng)。
注1：不同感受態(tài)細胞最后的克隆陽性率會有所差別,，推薦使用轉化效率>108 CFU/μg的感受態(tài)細胞,；
注2：菌落數(shù)取決于PCR產物與線性化載體的數(shù)量和純度；
注3：陽性對照平板通常生長大量白色單菌落,，陰性對照平板只生長很少的菌落,。
7、陽性克隆檢測
挑取單菌落至10 μl ddH2O中混勻,，95℃裂解10 min 后,，取1 μl裂解液作為模板，進行菌落PCR鑒定,，或將單菌落接種至抗性培養(yǎng)基中培養(yǎng)過夜后,，提取質粒進行酶切鑒定。
注1：菌落 PCR 時建議至少使用一條通用引物,，避免假陽性結果,；
注2：必要時可進一步對陽性結果進行測序鑒定。
常見問題
問題描述 | 原因 | 解決方法 |
轉化效率低 | 感受態(tài)效率低下 | 使用新制備或妥善保存的感受態(tài)細胞,。 |
DNA片段比例不佳 | 按照說明書推薦的用量和比例配制反應體系,。載體和插入片段的濃度測定： 若線性化載體與插入片段已經過純化，且經電泳檢測條帶單一或無Smear殘留時，可使用超微量核酸蛋白檢測儀等基于分光光度法的儀器進行濃度測定,，但只有當A260/A280 在1.8~2.0之間時濃度值可信,；若線性化載體與插入片段未經過純化，也可使用瓊脂糖電泳測定樣品濃度,。 | |
DNA片段純度不夠 | 對載體和插入片段進行膠回收純化,。由于EDTA等金屬離子螯合劑會抑制無縫克隆反應，因此純化產物應溶解于ddH2O中,，切勿使用Tris-EDTA等緩沖液,。 | |
反應產物過量 | 在轉化體系中，無縫克隆反應產物體積不應超過感受態(tài)細胞體積的10%,。 | |
大量克隆不含插入片段 | 載體線性化不完全 | 酶切制備線性化載體時,，提高快速內切酶的使用量，延長反應時間,，使用膠回收純化酶切產物,。 |
相同抗性質粒污染 | 以質粒為模板進行插入片段 PCR 擴增時，使用預線性化質粒作為擴增模板,，使用DpnI 等甲基化敏感型內切酶對擴增產物進行處理,，或對產物進行膠回收純化。 | |
平板抗性不足 | 確保使用正確的抗生素,，并使用新鮮制備的抗生素平板,。 | |
大量克隆含有 不正確插入片段 | 非特異性PCR擴增產物 | 優(yōu)PCR體系，提高擴增特異性,，或膠回收純化PCR產物重疊序列的擴增引物,。 |
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