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LabpO TOPO-TA/Blunt通用克隆試劑盒

(不含多克隆酶切位點(diǎn)MCS)

產(chǎn)品貨號(hào)：PT0102

儲(chǔ)存溫度：－20℃儲(chǔ)存,，至少12個(gè)月。冰袋運(yùn)輸,，1-2 天置于室外常溫不影響質(zhì)量。

產(chǎn)品介紹：

本制品和傳統(tǒng)的T4連接酶原理不同，它利用了Topoisomerase可以在瞬間（幾sec-幾min）,、高效,，連接DNA片段的原理采用本公司du創(chuàng)的工藝制成。

（1）可以在瞬間（幾sec-幾min）完成任意PCR產(chǎn)物（兼容A末端/平末端）連接,。

（2）特制的新型載體質(zhì)粒大小僅僅不到2kb,，充分發(fā)揮了TOPO載體越小,，可容納片段越大的優(yōu)勢(shì),，最da限度提高了大片段連接效率,；連接后質(zhì)粒大小比傳統(tǒng)載體小2kb以上，質(zhì)粒越小,，轉(zhuǎn)化效率越高,，極大的提高了各種片段連接后的轉(zhuǎn)化子數(shù)量,。

（3）采用氨芐抗性載體只需10min復(fù)蘇時(shí)間,，比卡那抗性載體1小時(shí)復(fù)蘇時(shí)間縮短6倍。

（4）最ku可以不用冰浴和熱休克,，室溫5min內(nèi)完成轉(zhuǎn)化,；無(wú)需1小時(shí)復(fù)蘇,，只需37℃10 min復(fù)蘇便可以涂板。從連接到涂板最kuai只需15-20min,。

（5）自sha基因零背景原理,，無(wú)自連假陽(yáng)性，無(wú)需繁瑣藍(lán)白斑篩選和菌落PCR篩選,。大部分情況下隨機(jī)挑一個(gè)克隆便是有插入的,。

（6）連接長(zhǎng)片段能力遠(yuǎn)超傳統(tǒng)TA/Blunt克隆載體，可連接長(zhǎng)達(dá)10kb片段（例如連接5kb片段,，也可能達(dá)到挑10個(gè)菌落,，至少8個(gè)是有插入的效果），是新一代世jie領(lǐng)xian的簡(jiǎn)單,、快速,、零背景免篩選的TOPO TA/Blunt克隆載體。

本制品在克隆插入位點(diǎn)兩側(cè)不含多克隆酶切位點(diǎn)（Simple）,，需要時(shí)可在 PCR 擴(kuò)增引物上導(dǎo)入合適的酶切位點(diǎn),。此時(shí)如果使用PCR 擴(kuò)增引物導(dǎo)入的酶切位點(diǎn)進(jìn)行酶切時(shí)， 酶切反應(yīng)將不會(huì)受到載體上其它多克隆酶切位點(diǎn)影響,，可大大提高酶切效率,，增加亞克隆成功率。

注意：測(cè)序只能采用M13F/M13R通用引物測(cè)序（見(jiàn)后面圖譜）,，但是不能采用M13(-47)/M13(-48)通用引物測(cè)序,。菌落PCR可使用和測(cè)序相同的引物。

操作步驟：

1.連接反應(yīng)的準(zhǔn)備：

PCR引物使用正常設(shè)計(jì)的引物即可,，不需做任何改變（不能用磷酸化引物）,。任意PCR產(chǎn)物（兼容A末端/平末端）均可以直接連接。PCR產(chǎn)物一般建議膠回收純化,，這樣可以避免后續(xù)可能的問(wèn)題,。如果PCR產(chǎn)物僅有目的條帶、無(wú)非特異條帶和引物二聚體,，也可嘗試直接進(jìn)行連接反應(yīng),。如果是以質(zhì)粒為模板的PCR產(chǎn)物則最hao進(jìn)行純化，因?yàn)槟０遒|(zhì)粒也可能長(zhǎng)出菌落（但不是想構(gòu)建的目的載體）,。

2.連接反應(yīng)：

1）室溫（25℃-37℃）設(shè)立10ul連接體系（建議用0.2ml PCR 管,，PCR儀器控溫）：

加完試劑后，用移液器輕輕吹打混勻或者輕彈管底混勻,，低速瞬時(shí)離心收集所有液體在離心管底,，注意此步驟不能在冰上進(jìn)行,，只能在室溫（25℃-37℃）進(jìn)行。

注：如果使用5ul體系連接,，各成分按照比例減半使用,，使用次數(shù)可以加倍。不同大小插入片段的推薦用量（注意過(guò)量太多了,，反而導(dǎo)致轉(zhuǎn)化子減少）

2）室溫（25℃-37℃）連接5min。

本載體推薦室溫（25℃-37℃）5min完成連接,。長(zhǎng)片段或者連接困難片段可以延長(zhǎng)連接時(shí)間到10-15min,，溫度可選37℃，可顯著增加轉(zhuǎn)化子數(shù)量,。

3）連接產(chǎn)物置于冰上備用,。立即接標(biāo)準(zhǔn)的感受態(tài)轉(zhuǎn)化步驟或者快速轉(zhuǎn)化步驟。

3.快速轉(zhuǎn)化：

1)感受態(tài)細(xì)胞從-80℃拿出,，迅速插入冰浴中,，解凍融化（約1-3min左右）。

2)立刻加入5ul連接液(最多可全部加入,，只要體積不超過(guò)感受態(tài)細(xì)胞體積的1/10),， 用手撥da離心管底輕輕混勻(避免用槍吸打)，冰浴放置5min,。

3)42℃水浴熱激60秒,，迅速放回冰浴靜置2-3min，該過(guò)程不要搖動(dòng)離心管,。

注意：此步驟首xuan建議 42℃水浴 60 秒熱激,。但是根據(jù)經(jīng)驗(yàn)，大部分商品化diyi0和DH5a感受態(tài)細(xì)胞此步驟也可將離心管置于室溫（?22℃）進(jìn)行,， 時(shí)間不需十分準(zhǔn)確,，夏季或室溫較高時(shí)，可放置 5-8min左右,；如果室溫較低,，可延長(zhǎng)時(shí)間至8-15min左右。有經(jīng)驗(yàn)的客戶可以根據(jù)具體情況嘗試無(wú)熱激轉(zhuǎn)化,。

4）加 300-500ul LB或者SOC培養(yǎng)基(不含抗生素),，37℃ 200 rpm 振蕩培養(yǎng)10min。

根據(jù)經(jīng)驗(yàn),，一般可以直接將培養(yǎng)基（如從冰箱取出溫度低,，應(yīng)事先置37℃溫箱回溫至22℃-37℃）加入到感受態(tài)細(xì)胞的1.5 ml 離心管，蓋上離心管蓋,，水平固定在振蕩培養(yǎng)箱中振蕩培養(yǎng)復(fù)蘇即可,，不需要轉(zhuǎn)移到試管培養(yǎng)復(fù)蘇,。

一般商品化的感受態(tài)細(xì)胞不超過(guò) 2kb 插入片段情況下,，熱休克后 10-15 min復(fù)蘇可以得到足夠多轉(zhuǎn)化子,，如果使用實(shí)驗(yàn)室自制的感受態(tài)效率低、或者轉(zhuǎn)化子少,、插入片段長(zhǎng)的情況下可以提高復(fù)蘇時(shí)間到 30-60 min以得到更多的轉(zhuǎn)化子,。

5）取100-200ul菌液涂板(培養(yǎng)板含氨芐青霉素100ug/ml），培養(yǎng)過(guò)夜,。（如果預(yù)計(jì)轉(zhuǎn)化子少,，為得到較多克隆，4000rpm 離心1min,，吸棄掉部分上清,，保留100-150ul，輕彈懸浮菌體,，取全部菌液涂板）,。

4.轉(zhuǎn)化子的篩選鑒定：

本制品采用自sha基因零背景原理，無(wú)插入自連的細(xì)菌會(huì)自sha無(wú)法生長(zhǎng),，因此幾乎沒(méi)有假陽(yáng)性,，一般情況下，可以達(dá)到所見(jiàn)即所得,，只要是長(zhǎng)出來(lái)的菌落正常（不是污染的雜菌,，轉(zhuǎn)化子數(shù)量也不算太少），基本就包含插入,。因此插入片段不超過(guò) 2-3kb 的情況下可以不用菌落PCR 鑒定,直接挑1-2個(gè)菌去測(cè)序,。

1）一般本公司TOPO 載體陽(yáng)性率非常高，所以菌落生長(zhǎng)正常,，數(shù)量也不是太少的情況下建議省略菌落PCR/菌液PCR鑒定直接去測(cè)序,。

注意測(cè)序引物不能采用M13(-47)/M13(-48)通用引物測(cè)序。

2) TOPO載體的菌落 PCR 結(jié)果容易出現(xiàn)假陰性,。因此在使用菌落 PCR 鑒定的情況下,，如菌落PCR結(jié)果陽(yáng)性，一般可以相信此結(jié)果,。如結(jié)果是陰性,，或者顯示擴(kuò)增出大小和預(yù)期不符合，一般不可相信,，要考慮到菌落 PCR 結(jié)果假陰性的可能,。需要進(jìn)一步提取質(zhì)粒電泳跑大小，或者酶切鑒定來(lái)確認(rèn),。

3) 用上述培養(yǎng)的白色菌落的菌液抽提質(zhì)粒,，插入片段較大的情況下,，直接跑電泳看質(zhì)粒大小就直接能鑒定出有插入的質(zhì)粒，還可用ApaI/BglI/BsaHI,，或者插入片段上引入的酶切位點(diǎn)酶切鑒定,，瓊脂糖凝膠電泳檢查片段大小，確定是否含有目的片段,。

pTOPO-TA/Blunt 載體圖譜：

pTOPO-TA/Blunt 載體多克隆位點(diǎn)序列：