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Calcein AM /PI試劑盒

貨號：C30002

存儲溫度：4℃避光干燥

產(chǎn)品簡介：

鈣黃綠素-AM (Calcein-AM)和碘化丙啶(PI)溶液，分別對活細胞和死細胞染色，可用于同時對活細胞和死細胞進行熒光染色,。Calcein-AM的乙酸甲基酯親脂性很高,，使其可透過細胞膜。盡管Calcein-AM本身并不是熒光分子,，但通過活細胞內的酯酶作用,，Calcein-AM能脫去AM基，產(chǎn)生的Calcein能發(fā)出強綠色熒光(激發(fā): 490 nm,，發(fā)射: 515 nm),。因此Calcein-AM僅對活細胞染色。另一方面,，作為核染色染料的PI不能穿過活細胞的細胞膜,。它穿過死細胞膜的無序區(qū)域而到達細胞核，并嵌入細胞的DNA雙螺旋從而產(chǎn)生紅色熒光 (激發(fā): 535 nm,，發(fā)射: 617 nm),。由于Calcein和PI-DNA都可被490 nm激發(fā)，因此可用熒光顯微鏡同時觀察活細胞和死細胞,。用545 nm激發(fā),，僅可觀察到死細胞。由于不同細胞系的最shi染色條件不同,，我們建議個別確定Calcein-AM和PI的合適濃度,。

試劑

Calcein-AM 2mM 50uL in DMSO; PI (2mM) 150uL in water

用熒光顯微鏡觀察細胞形態(tài)

以HeLa細胞染色為例，請注意不同的細胞種類,、不同濃度,，有不同的觀察條件。根據(jù)細胞條件,，摸索不同條件下的細胞貼壁情況和試劑濃度的配制等最shi條件,。

1. 染色溶液的配制

1) 用1 ml無水DMSO溶解2 mg Calcein-AM，制備成2 mmol/l的Calcein-AM儲備液,，-20℃下密閉冷凍保存,。

2) 用1 ml ddH2O溶解2 mg PI，制備成2 mmol/l的PI儲備液,，-20度下密閉冷凍保存,，可以保存一年。

3) 將Calcein-AM儲備液和PI儲備液放置于室溫,。

4) 加5 µl Calcein-AM儲備液和15 µl PI儲備液至5 ml PBS中配制成染色溶液,。Calcein-AM的終濃度為2 µmol/l，PI的終濃度為4.5 µmol/l,。

2. 細胞染色

1) 染色HeLa細胞等貼壁細胞時,，先用Trypsin-EDTA等消化細胞，制備成細胞懸液。

2) 將細胞懸液離心3分鐘 (1,000 rpm),。

3) 去除上清液,，加入PBS緩沖液，細胞數(shù)量調整至10e5-10e6個/ml,。再用移液器充分混勻,。

4) 由于培養(yǎng)基中的血清等含有酯酶，Calcein-AM遇水會分解,，會導致空白上升,，所以需要離心數(shù)次，用PBS洗滌數(shù)次直到*洗凈,。

5) 將200 µl細胞懸液移至小試管中,，加入100 µl染色溶液，在37℃下孵育15分鐘,。

6) 在蓋玻片上滴加適量的染色的細胞溶液,。

7) 在熒光顯微鏡下，先用490±10 nm波長激發(fā),，觀察黃綠色的活細胞,，還可以同時觀察到紅色的死細胞，然后用545 nm波長激發(fā),，能夠看到紅色的死細胞,。

3. 染色試劑的最shi濃度

  Calcein-AM和PI最shi濃度根據(jù)不同的細胞種類而定,，通過以下的操作,，我們可以找到不同細胞染色試劑的最shi濃度。

1) 通過在0.1%皂苷或0.1-0.5%毛地黃皂苷中孵育10分鐘或通過在70%乙醇中孵育30分鐘制備死細胞,。

2) 用0.1-10 µM PI溶液對死細胞染色,，以便找到僅對細胞核染色而不對細胞質染色的PI濃度,。

3) 用0.1-10 µM Calcein-AM溶液對死細胞染色，以便找到不對細胞質染色的Calcein-AM濃度,。接著用該濃度的Calcein-AM對活細胞染色以檢驗活細胞可否被染色,。

注意事項

1) Calcein-AM的ester部位遇到濕氣會分解，使用后請在-20度下密閉冷凍保存,，防止水分進入,。Calcein-AM儲備液用緩沖液或培養(yǎng)基等稀釋時盡量現(xiàn)配現(xiàn)用。

2) 使用時一定要帶手套,、眼罩,、口罩。萬一接觸到皮膚的話,，迅速使用大量水清洗,。

產(chǎn)品參數(shù)