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RIPA裂解液（強）

保存條件：-20℃,。

產品簡介：

RIPA裂解液(RIPA Lysis Buffer)是一種傳統(tǒng)的細胞組織快速裂解液,。RIPA裂解液裂解得到的蛋白樣品可以用于常規(guī)的Western,、IP等。

RIPA裂解液(強)的主要成分為50mM Tris(pH 7.4),，150mM NaCl,，1%的triton ，1% sodium deoxycholate,，0.1% SDS,，以及sodium orthovanadate，EDTA,，leupeptin等多種抑制劑,。可以有效抑制蛋白降解,。

注意事項：     

1,、為取得最佳的使用效果，盡量避免過多的反復凍融,?？梢赃m當分裝后使用。
2,、需自備PMSF,。
3、裂解樣品的所有步驟都需在冰上或4℃進行,。

使用說明：

對于培養(yǎng)細胞樣品：

1.融解RIPA裂解液,，混勻。取適當量的裂解液,，在使用前數(shù)分鐘內加入PMSF，使PMSF的最終濃度為1mM,。

2.對于貼壁細胞：去除培養(yǎng)液,，用PBS、生理鹽水或無血清培養(yǎng)液洗一遍(如果血清中的蛋白沒有干擾，可以不洗),。按照6孔板每孔加入150-250微升裂解液的比例加入裂解液,。用槍吹打數(shù)下，使裂解液和細胞充分接觸,。通常裂解液接觸細胞1-2秒后,，細胞就會被裂解。

對于懸浮細胞：離心收集細胞,，用手指把細胞用力彈散,。按照6孔板每孔細胞加入150-250微升裂解液的比例加入裂解液。再用手指輕彈以充分裂解細胞,。充分裂解后應沒有明顯的細胞沉淀,。如果細胞量較多，必需分裝成50-100萬細胞/管,，然后再裂解,。

3.充分裂解后，10000-14000g離心3-5分鐘,，取上清,，即可進行后續(xù)的PAGE、Western和免疫沉淀等操作,。

裂解液用量說明：通常6孔板每孔細胞加入150微升裂解液已經(jīng)足夠,，但如果細胞密度非常高可以適當加大裂解液的用量到200微升或250微升。

對于組織樣品：

1. 把組織jan切成細小的碎片,。

2. 融解RIPA裂解液,，混勻。取適當量的裂解液,，在使用前數(shù)分鐘內加入PMSF,，使PMSF的最終濃度為1mM。

3. 按照每20毫克組織加入150-250微升裂解液的比例加入裂解液,。(如果裂解不充分可以適當添加更多的裂解液,，如果需要高濃度的蛋白樣品，可以適當減少裂解液的用量,。)

4. 用玻璃勻漿器勻漿,，直至充分裂解。

5. 充分裂解后,，10000-14000g離心3-5分鐘,，取上清，即可進行后續(xù)的PAGE,、Western和免疫沉淀等操作,。

6. 如果組織樣品本身非常細小,，可以適當剪切后直接加入裂解液裂解，通過強烈vortex使樣品裂解充分,。然后同樣離心取上清,，用于后續(xù)實驗。直接裂解的優(yōu)點是比較方便,，不必使用勻漿器,，缺點是不如使用勻漿器那樣裂解得比較充分。

注：RIPA裂解液的裂解產物中經(jīng)常會出現(xiàn)一小團透明膠狀物,，屬正?，F(xiàn)象。該透明膠狀物為含有基因組DNA等的復合物,。在不檢測和基因組DNA結合特別緊密的蛋白的情況下,，可以直接離心取上清用于后續(xù)實驗；如果需要檢測和基因組結合特別緊密的蛋白,，則可以通過超聲處理打碎打散該透明膠狀物,，隨后離心取上清用于后續(xù)實驗。如果檢測一些常見的轉錄因子,，例如NF-kappaB,、p53等時，通常不必進行超聲處理,，就可以檢測到這些轉錄因子,。

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