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熒光標記鬼筆環(huán)肽555(橙紅)

產品貨號：G0060  

Abs/Em (nm)：555/565

存儲溫度：-20℃干燥,、避光保存,，有效期見外包裝。若配制成水溶液,，應小量分裝保存,。

注意事項

本產品為凍干粉形式，微量不易觀察,，使用前請瞬時離心,，加適當溶劑溶解后使用，溶解后的溶液近乎透明色,。

產品簡介

鬼筆環(huán)肽是從致命的傘形毒蕈蘑菇中分離出來的一種毒素,。 它是特異性結合于F-肌動蛋白的雙環(huán)肽。因此用熒光染料標記的鬼筆環(huán)肽可以非常方便的研究F-肌動蛋白的分布,。鬼筆環(huán)肽內部,，在半guang氨酸和se氨酸之間含有不常見的硫醚橋形成內環(huán)結構,。在pH升高時,，該硫醚被裂解，鬼筆環(huán)肽失去對肌動蛋白的親和力,。

熒光標記的鬼筆環(huán)肽可在納摩爾水平染色F-肌動蛋白,。在各種植物細胞或動物細胞中，標記的鬼筆環(huán)肽對大,、小細絲具有相似的親和力,，平均每個肌動蛋白亞基結合一個鬼筆環(huán)肽分子,。不同于抗體，鬼筆環(huán)肽與肌動蛋白的結合親和力在不同物種間沒有顯著變化,。非特異性染色可以忽略不計,，染色和未染色區(qū)域之間的對比度非常大。鬼筆環(huán)肽將單體/聚合物的平衡轉向聚合狀態(tài),，將聚合臨界濃度降低至30倍,。Phallotoxins可通過抑制細胞松弛素的解聚， 碘化jia和升高的溫度,，穩(wěn)定 F-肌動蛋白,，。因為鬼筆環(huán)肽綴合物很小,，大約直徑12-15埃,，分子量<2000道爾頓，多種肌動蛋白結合蛋白,，包括肌球蛋白,，原肌球蛋白和后肌鈣蛋白依然可以和鬼筆環(huán)肽標記的肌動蛋白結合。更重要的是,， 鬼筆環(huán)肽標記的肌動蛋白絲保持功能,，標記甘油肌纖維仍然收縮，標記的肌動蛋白絲仍然可以繼續(xù)移動,。而且熒光標記的鬼筆環(huán)肽也可用于對細胞中 F-肌動蛋白進行定量研究,。

實驗方法

儲液制備

熒光染料標記的鬼筆環(huán)肽：取適量甲醇或無菌水溶解棕色管中凍干的粉末，制備成200 T/mL的儲液（300T規(guī)格染料加入1.5 mL的液體,，50T規(guī)格染料加入0.25 mL的液體即可）,。

熒光標記鬼筆環(huán)肽的一個單位（T）的定義是染色一個加載細胞的載玻片所用染料的量。 對于熒光標記的鬼筆環(huán)肽,，使用時的推薦稀釋比例為1:40-1:200,，一個單位相當于200 μL總染色體積中加入1-5 μL 200T/mL儲備溶液。

注：稀釋比例可以根據(jù)實際染色效果進行適當調整,。

固定細胞染色

以下方案是針對生長在玻璃蓋玻片或8孔室玻片上的貼壁細胞的染色步驟,。鬼筆環(huán)肽也可用于染色固定的冷凍或石蠟組織切片。

1. 用PBS清洗細胞3次,。

2. 用含有3.75％甲醛的PBS溶液固定細胞,，冰上固定15 min。

注意：甲醇可以在固定過程中破壞肌動蛋白,。因此最好避免含有任何甲醇的固定劑,。優(yōu)選的固定劑是不含甲醇的甲醛。

3. 用PBS清洗細胞3次,。

4. 用含0.5％Triton X-100的PBS溶液在室溫下透化細胞10 min,。

5. 用PBS清洗細胞3次,。

6. 用200μL PBS稀釋1-5 μL熒光標記的鬼筆環(huán)肽儲液，加入一個蓋玻片或孔中,，室溫孵育20min,，進行染色。

注：染色體積可根據(jù)樣本情況進行調節(jié),。孵育過程中為避免染液揮發(fā),，可將蓋玻片放于密封容器內。

7. 用PBS清洗細胞2-3次,。

8. 熒光顯微鏡觀察,。標記的鬼筆環(huán)肽具有很好的光穩(wěn)定，樣品可以在PBS中成像,，但為了效果zui 佳,，也可以使用抗熒光淬滅劑觀察。

活細胞染色

熒光標記的鬼筆環(huán)肽不具有細胞透性,，因此沒有被廣泛用于活細胞標記,。然而，有報道稱活細胞可能通過胞飲或未知機制進行標記,。一般來說,，染色活細胞時需要更多的染料?；蛘?，熒光標記的鬼筆環(huán)肽也可被注入到細胞中用于監(jiān)測肌動蛋白分布和細胞運動。