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  Long Taq DNA Ploymerase

貨號(hào)：LT0201

儲(chǔ)存溫度：-20^。C,，濃度5U/ul,。

產(chǎn)品組成、濃度

產(chǎn)品介紹

一般PCR法具有一定的局限性，特別是難以擴(kuò)增5kb以上的長(zhǎng)鏈DNA,，這嚴(yán)重限制了PCR法的推廣和應(yīng)用,。通過改變PCR用DNA聚合酶、PCR用Buffer,、PCR擴(kuò)增條件等,，使長(zhǎng)鏈DNA的擴(kuò)增成為可能，這就是LA（Long and Accurate）PCR技術(shù),。本試劑盒所用的Long Taq是Taq聚合酶和有矯正作用的聚合酶的混合物,，這種聚合酶可以染色體和其他細(xì)胞器的DNA為模板高效進(jìn)行PCR反應(yīng)。在人的染色體上可以擴(kuò)增長(zhǎng)度可達(dá)27kb的DNA片段,，而以λDNA為模板則可擴(kuò)增出高達(dá)40kb的片段,。

適用范圍

一般用于DNA片段的PCR擴(kuò)增、DNA標(biāo)記,、引物延伸,、序列測(cè)定、DNA平末端加A等,，產(chǎn)物可直接用于TA克隆,。

建議循環(huán)條件

*擴(kuò)增大片段尤其是20kb以上的片段建議15-30個(gè)循環(huán),，每個(gè)循環(huán)的延伸時(shí)間要增加10-15sec“自動(dòng)延伸"時(shí)間，如果PCR儀器沒有“自動(dòng)延時(shí)"功能,，那么設(shè)定延伸時(shí)間建議在原有基礎(chǔ)上增加1-4min,。

注意事項(xiàng)：

1.10xLong Taq Buffer pH值較高，可能會(huì)形成【Mg(OH)2】沉淀,，使用蒨要充分溶解,，并用Votex保證可能的沉淀重新溶解，或者37^,。C溫育5min,，然后Votex充分混勻。

2. 擴(kuò)增長(zhǎng)片段建議使用0.2ul薄壁管,。其他試管未經(jīng)測(cè)試,。較厚的試管在92^,。C時(shí)不能有效的使模板變性。變性時(shí),，盡可能縮短變性時(shí)間,，降低變性溫度。第一步變性在92^,。C-94^,。C下進(jìn)行2min（GC含量高可能延長(zhǎng)時(shí)間達(dá)5min）。再循環(huán)過程中盡可能縮短變性時(shí)間（92^,。C-94^,。C下進(jìn)行10-15s），除非模板中富含GC,，則95^,。C下變性30s，這可以防止DNA脫嘌呤和鏈斷裂,，對(duì)于所需擴(kuò)增的基因組DNA片段中長(zhǎng)度超過12kb時(shí)，應(yīng)盡可能降低變性溫度和時(shí)間,。變性需要的時(shí)間在不同PCR儀上稍有不同,。

3. 如果擴(kuò)增片段GC含量高或者擴(kuò)增片段比較長(zhǎng)，可在反應(yīng)混合物中加入DMSO到終濃度1%-8%,，zui常用2%（小于30kb）或者4%（大于30kb）往往會(huì)改善擴(kuò)增效果,。

4. 擴(kuò)增長(zhǎng)片段，引物一般終濃度為0.3-1uM,，長(zhǎng)度最好為27-36bp,；退火溫度一般在65^。C-70^,。C,，此時(shí)退火溫度和延伸溫度基本一致，可將退火延伸在一個(gè)溫度進(jìn)行,，使用2階段擴(kuò)增法,。當(dāng)然如果設(shè)計(jì)的引物在20bp左右，則還是使用傳統(tǒng)3階段擴(kuò)增法,。

5. 模板一般使用0.01-2.5ng(λ phage)或者0.1-1ug（human）,。

6. 1xLong Taq buffer中Mg2+濃度為2.5mM，建議dNTP濃度為400mM,，要得到最佳結(jié)果,，優(yōu)化Mg2+是必須的。如果含有較高的EDTA或螯合劑,，則應(yīng)該提高M(jìn)g2+,；如果要增加dNTP濃度,，相應(yīng)的也要增加Mg2+濃度。