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| 供貨周期 | 現(xiàn)貨 | 貨號 | G4180 |
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G418 (Geneticin) 遺傳霉素
產(chǎn)品貨號：G4180
儲存溫度：常溫運輸,。-20℃避光保存,，有效期 3 年。避免受潮,，否則會降低抗生素活力,。
產(chǎn)品描述
G418是一種結(jié)構(gòu)類似于慶da霉素 B1（Gentamycin B1）的氨基糖苷類抗生素，在分子遺傳試驗中,，是穩(wěn)定轉(zhuǎn)染zui常用的抗性篩選試劑,，。它通過抑制轉(zhuǎn)座子 Tn601,，Tn5 的基因,，干擾核糖體功能而阻斷蛋白質(zhì)合成， 對原核和真核等細(xì)胞產(chǎn)生毒素,，包括細(xì)菌,、酵母、植物和哺乳動物細(xì)胞 ,也包括 原生動物和蠕蟲,。當(dāng)抗性基因neo被整合進(jìn)真核細(xì)胞基因組后 , ,則能啟動neo基因編碼的序列轉(zhuǎn)錄為 mRNA,，從而獲得抗性產(chǎn)物氨基糖苷磷酸轉(zhuǎn)移酶的高效表達(dá)，此酶通過共價修飾 G418 的氨基或羥基功能,，抑制抗生素-核糖體間的相互作用,，從而使得抗生素失活。這一特性賦予細(xì)胞產(chǎn)生抗性,。穩(wěn)轉(zhuǎn)細(xì)胞株篩選實驗,，需要建立殺滅曲線（劑量反應(yīng)曲線）確定殺死無抗性細(xì)胞的最di有效濃度。植物細(xì)胞中,，通過轉(zhuǎn)染攜帶 nptII 基因的抗性質(zhì)粒孵育其抗性,。nptII 基因也能編碼表達(dá)氨基糖苷磷酸轉(zhuǎn)移酶，這個酶使 得多種抗生素喪失活性,，包括 G418,，卡na霉素和ba龍霉素。
產(chǎn)品性質(zhì)
英文別名（English synonym） | Antibiotic G418; G418 Sulfate |
中文別名（Chinese Synonym） | G418 硫酸鹽,；遺傳霉素 |
CAS號（CAS NO.） | 108321-42-2 |
分子式（Formula） | C20H40N4O10·2 H2SO4 |
分子量（Molecular weight） | 692.7 g/mol |
外觀（Appearance） | 白色粉末 |
純度（Purity） | >700Ug/mg |
溶解性（Solubility） | 溶于水 |
結(jié)構(gòu)式（Structure） |  |
使用方法
1. G418 儲存液的配制（50 mg/mL,，活性濃度）
1）活力單位的換算 根據(jù)此公式進(jìn)行換算：（1000/A0）×A1=A2,，其中 A0是 G418 的
活力值（Potency），因批次而異,?？梢娕螌?yīng)的質(zhì)檢報告， 或者瓶子上的標(biāo)簽,。A1 是想配制的活性 G418 濃度,。A2 是實際稱重的粉末與體積比濃度。 比如若所用批次的 G418
活力值為：750 U/mg,，要配制 50 mg/mL 的 G418 活性濃度,，則實際要配制的粉末濃度為 1000/750×50 mg/mL=66.33 mg/mL。 如果配制 10 mL 的 G418 儲存液（活性濃度,，50 mg/mL）,，則需要稱取 663.3 mg 粉末。
2）除菌和保存 根據(jù)上述換算得到的實際粉末稱重量,，加入 10 mL 無菌去離子水內(nèi)使其wan全溶解,。 先用 5 mL 無菌去離子水預(yù)濕潤 0.22 μm 針頭式過濾器，除盡水,。之后使用此濾器過濾,，除菌后分裝成單次使用的小量（如 1mL）放到-20℃凍存，1 年穩(wěn)定,。
【注】①不要對混濁的溶液進(jìn)行過濾,，因為混濁的溶液意味著未wan全溶解，過濾過程中會造成藥物損失,，降低終液的活性,。 ②不建議使用液體培養(yǎng)基，NaCl,，磷酸鹽溶液或者有機(jī)溶劑來制備儲存液,。
2. 常用篩選濃度
一般來說，剛開始篩選轉(zhuǎn)化子需要高濃度的 G418,，并用一個較低濃度的 G418 用于維持培養(yǎng),。生長條件，細(xì)胞類型和其他 的環(huán)境因素都可能影響 G418 的用量,，因此第一次使用的實驗體系建議通過殺滅曲線（kill curve）,，即劑量反應(yīng)性曲線，來確 定最佳篩選濃度,。 通常情況,，哺乳動物細(xì)胞篩選范圍 200-2000 μg/mL；植物細(xì)胞：10-100 μg/mL；酵母細(xì)胞：500-1000 μg/mL,；
以下是一些細(xì)胞類型使用 G418 篩選使用的濃度,，可做參考。
3.殺滅曲線的建立
【注】為了篩選得到穩(wěn)定表達(dá)目的蛋白的細(xì)胞株,，需要確定能夠殺死未轉(zhuǎn)染宿主細(xì)胞的抗生素最di濃度,，可通過建立殺滅曲 線（劑量反應(yīng)曲線）來實現(xiàn)，至少選擇 6 個濃度,。處理分裂期的細(xì)胞時 G418 的活性最qiang,，因此在添加 G418 之前需 要讓細(xì)胞培養(yǎng)一段時間。
1）第一天：未轉(zhuǎn)化的細(xì)胞按照 20-25%的細(xì)胞密度鋪在合適的培養(yǎng)板上,，37℃,，CO2 培養(yǎng)過夜；
【注】對于需要更高密度來檢測活力的細(xì)胞,，可增加接種量,。
2）根據(jù)細(xì)胞類型,，設(shè)定合適范圍內(nèi)的濃度梯度,。以哺乳動物細(xì)胞為例，可設(shè)定 0,，50,，100，200,，400,，800，1000 μg/mL,。
3）第二天：去除舊的培養(yǎng)基,，換用新鮮配制的含有相應(yīng)濃度藥物的培養(yǎng)基。每個濃度做三個平行孔,。
4）接下來每 3-4 天更換新的含藥物培養(yǎng)基,。
5）按照固定的周期（如每 2 天）進(jìn)行活細(xì)胞計數(shù)來確定阻止未轉(zhuǎn)染細(xì)胞生長的恰當(dāng)濃度。選擇在理想的天數(shù)（通常是 7-10 天）內(nèi)能夠殺死絕大多數(shù)細(xì)胞的最di濃度為穩(wěn)定轉(zhuǎn)染細(xì)胞篩選用的工作濃度,。
4. 穩(wěn)定轉(zhuǎn)染細(xì)胞的篩選
1）轉(zhuǎn)染 48 h 后,，用含有適當(dāng)濃度的 G418 篩選培養(yǎng)基來傳代細(xì)胞（直接傳代或者稀釋后傳代）。
【注】細(xì)胞處于活躍分裂狀態(tài)時抗生素的殺傷效果zui 好,。則當(dāng)細(xì)胞過于稠密,，其效率會降低。為了得到j(luò)iao好的篩選效guo,，最 好將細(xì)胞稀釋至豐度不超過 25%,。
2）每隔 3-4 天更換含有藥物的篩選培養(yǎng)液。
3）篩選 7 天后觀察并評估細(xì)胞克隆（集落）的形成情況,。集落的形成可能還需要一周或者更多的時間,，這取決于宿主細(xì)胞 類型，轉(zhuǎn)染,，以及篩選效果,。
4）挑取并轉(zhuǎn)移 5-10 個抗性克隆于 35 mm 細(xì)胞培養(yǎng)板，繼續(xù)用含藥物的篩選培養(yǎng)液維持培養(yǎng) 7 天,。
5）之后更換正常培養(yǎng)基培養(yǎng)即可,。
注意事項
1）本品不可高壓滅菌；
2）G418不要和其他的抗生素/抗真菌劑（如qing霉素/lian霉素）共同使用,，因為它們是G418的競爭性抑制劑,。其他的抗生素也 會產(chǎn)生交叉活性。
3）配制G418溶液時,，一定要根據(jù)G418批次不同的活力值（potency）來進(jìn)行換算,，從而得到需要活性濃度的儲存液以及工作液。
4）G418加入培養(yǎng)體系中未轉(zhuǎn)染的細(xì)胞有可能不會被殺死,，原因在于藥物濃度過低,，或者細(xì)胞密度過高。另外,，快速分裂的細(xì)胞相對于緩慢增殖細(xì)胞,，更容易被殺死。對照細(xì)胞（未轉(zhuǎn)染）可能抗生素添加5-7天后才能殺死,，轉(zhuǎn)染細(xì)胞（抗性克隆子）的克隆需要10-14天形成,。
5）即使加入殺死劑量的G418，細(xì)胞可能會繼續(xù)分裂2-3次,。G418的藥效通常在2天后才變得明顯,。
6）為了您的安全和健康，請穿實驗服并戴一次性手套操作,。
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