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活性氧 檢測試劑盒

產品貨號：O040

保存溫度：-20℃，避光保存一年

產品組分：

產品簡介：

活性氧檢測試劑盒（Reactive Oxygen Species Assay Kit）是一種利用熒光探針H2DCFH-DA進行活性氧檢測的試劑盒,。H2DCFH-DA本身沒有熒光，可以自由穿過細胞膜,，進入細胞內后,，可以被細胞內的酯酶水解生成DCFH,。而DCFH不能通透細胞膜，從而使探針很容易被裝載到細胞內,。細胞內的活性氧可以氧化無熒光的DCFH生成有熒光的DCF,。檢測DCF的熒光就可以知道細胞內活性氧的水平。根據活細胞中熒光的產生,，可以判斷細胞活性氧的含量和變化,。用流式細胞儀或熒光顯微鏡可直接觀察，是一種經典的組織或活細胞中活性氧檢測方法,。本試劑盒提供了活性氧陽性對照試劑Rosup，以便于活性氧的檢測,。Rosup是一種混合物,，濃度為50mg/mL。Rosup 為活性氧陽性誘導藥物,，根據其熒光信號強度,，可分析活性氧的真正水平。

本試劑盒本底低,，靈敏度高,，線性范圍寬，使用方便,。本試劑盒可以測定1000個樣品1000T(96 孔板),。

注意事項：

1. 探針裝載后，一定要洗凈殘余的未進入細胞內的探針,，否則會導致背景較高,。

2. 陽性對照Rosup 一般使用濃度為100 μM （推薦濃度100-400μM，具體依細胞類型而定）,。通常刺激后0.5-4h 可觀察到顯著的活性氧水平升高,。對于不同的細胞，活性氧陽性對照的效果可能有較大的差別,。如果在刺激后30min 內觀察不到活性氧的升高,，可延長誘導時間或適當提高活性氧陽性對照的濃度。如果活性氧升高得過快,，可縮短誘導時間或適當降低活性氧陽性對照的濃度,。

3. 對于某些特別的細胞，實驗過程中如果發(fā)現沒有刺激的陰性對照細胞熒光也比較強,， 可以按照1:2000-1:5000 稀釋DCFH-DA,， 使DCFH-DA 的終濃度為2-5 μM。探針裝載的時間也可以根據情況在15-60 min 內適當進行調整,。

4. 活性氧陽性對照(Rosup) 僅僅用于作為陽性對照的樣品,，并不是在每個樣品中都需加入活性氧陽性對照。

5. 探針裝載完畢并洗凈殘余探針后，可以進行激發(fā)波長的掃描和發(fā)射波長的掃描,，以確認探針的裝載情況是否良好,。DCF的激發(fā)光譜和發(fā)射光譜請參考上圖。

6. 盡量縮短探針裝載后到測定所用的時間（刺激時間除外）,，以減少各種可能的誤差,。

7. 為了您的安全和健康，請穿實驗服并戴一次性手套操作,。

8. 定量的話要作標準曲線吧,。先做一個不同濃度H2O2氧化DCFA熒光值，做一條標準曲線,，X軸為H2O2濃度,，y軸是熒光值，得出一個方程,，在看你樣品的熒光值即Y值是多少,，對應的X值就是。

9. 有的細胞裝載探針后細胞容易漂起來,，洗細胞時實驗組會吸走一部分細胞,。所以種細胞時細胞量增加一倍，這樣細胞緊密連接,，貼壁比較牢,，實驗組的熒光值就高了。另外的H2DCFDA很敏感,，工作液濃度要低一些,，1-2μM就夠啦，濃度太高容易有非特異性染色,。這個探針很不穩(wěn)定,，一旦氧化了本底熒光值就會升高，最好工作液現用現配,。

使用說明：

1. 裝載ROS 探針

1.1 原位裝載探針(僅適用于貼壁細胞)

a) 細胞準備：檢測前一天進行細胞鋪板,，確保檢測時細胞數量小于5×105/ml。

b) 藥物誘導：去除細胞培養(yǎng)液,，加入無血清培養(yǎng)基稀釋的藥物處理,，于37℃細胞培養(yǎng)箱內避光孵育，實際誘導時間由藥物特性和細胞類型決定,。

c) （可選）陽性對照：先用無血清培養(yǎng)基等稀釋陽性對照（Rosup, 100 mM）到常用工作濃度100 μM,，加入細胞，37℃避光孵育0.5～4 h,，以提高活性氧水平,，不同細胞類型存在差異,。例如：HeLa 細胞需孵育30-60 min，MRC5 人胚胎成纖維細胞則需孵育90 min,。

d) ROS 探針準備：探針裝載前按照1:1000 用無血清培養(yǎng)液稀釋DCFH-DA,，使其終濃度為10 μM。

e) ROS 探針裝載：吸除處理藥物,，加入適當體積稀釋好的DCFH-DA 工作液,。加入的體積需充分蓋住細胞。例如：6孔板通常不少于1000 μL,，對于96 孔板通常不少于100 μL,。37℃細胞培養(yǎng)箱內避光孵育30 min。

f) 細胞清洗：用無血清培養(yǎng)液洗滌細胞1～2 次,，以充分去除未進入細胞內的DCFH-DA,。

1.2 收集細胞后裝載探針(適用于貼壁細胞和懸浮細胞)

a) 細胞準備：按照標準方法培養(yǎng)細胞，必須保證檢測用細胞狀態(tài),。按照適當方法，清洗并收集足量的細胞,。

b) 藥物誘導：將收集好的細胞懸浮于適量稀釋好的藥物,，于37℃細胞培養(yǎng)箱內避光孵育，實際誘導時間由藥物特性和細胞類型決定,。

c) （可選）陽性對照：先用無血清培養(yǎng)基稀釋陽性對照（Rosup, 100 mM）到常用工作濃度100 μM,，加入細胞，37℃避光孵育0.5～4 h 以提高活性氧水平,，不同細胞類型存在差異,。例如：HeLa 細胞需孵育30-60 min，MRC5 人胚胎成纖維細胞則需孵育90min,。

d) ROS 探針準備：探針裝載前,，按照1:1000 用無血清培養(yǎng)液稀釋DCFH-DA，使其終濃度為10 μM,。

e) 探針裝載：除去細胞內藥物,，離心收集細胞，加入稀釋好的探針,，使其細胞密度為1×106 ～ 2×107,。

注意：細胞密度需根據后續(xù)的檢測體系，檢測方法,，以及檢測總量來進行調整,。例如：對于流式分析，單管檢測內細胞數目不少于104,，也不可多于106,。

f) 細胞清洗：用無血清細胞培養(yǎng)液洗滌細胞1-2 次,，以充分去除未進入細胞內的DCFH-DA。

2. 熒光顯微照相操作方法

a) 對貼壁生長細胞或活組織,，可直接在熒光顯微鏡下觀察,；對懸浮生長細胞，取25-50 μL 細胞懸液滴到一張顯微載玻片上,，再蓋上一張蓋玻片,。

b) 熒光顯微鏡下，選用FITC 濾光片觀察熒光,，去除背景觀察熒光的變化,。

3. 流式細胞分析操作方法

a) 對貼壁生長細胞，用yi酶消化制備成單細胞懸液,；對懸浮生長細胞,，直接收集細胞。用0.5-1 mL PBS 重懸細胞(0.5～1 x 105/ml),。

b) 選擇流式細胞儀FL1 或BL1 通道,，488nm 激發(fā)，測定530nm 的發(fā)射,，細胞應可分成兩個亞群：ROS 陰性細胞僅有很低的熒光強度,，ROS 陽性細胞有較強的綠色熒光。

4.參數設置

使用488nm激發(fā)波長,，525nm發(fā)射波長,，實時或逐時間點檢測刺激前后熒光的強弱。DCF的熒光光譜和FITC非常相似,，可以用FITC的參數設置檢測DCF,。DCF的激發(fā)光譜和發(fā)射光譜參考下圖。

使用活性氧檢測試劑盒(Reactive oxygen species assay kit)顯示CHO細胞內活性氧熒光,。

左圖：CHO細胞用試劑盒配備的活性氧陽性對照處理,；右圖：正常CHO細胞。綠色熒光表明細胞活性氧急劇增加,，并能顯示其定位,。