目錄:北京蘭博利德商貿有限公司>>蛋白研究>>IP/CoIP>> FNA-50-1000DYKDDDDK-Nanoab-Agarose
| 供貨周期 | 現貨 | 貨號 | FNA-50-1000 |
|---|
DYKDDDDK-Nanoab-Agarose
貨號：FNA-25-500 FNA-50-1000
保存條件：4℃一年,；-80℃長期保存,，避免反復凍融
產品描述
偶聯(lián)anti-DYKDDDDK-tag納米抗體的瓊脂糖珠子用于免疫沉淀DYKDDDDK-tag (DYKDDDDK)融合蛋白,。
產品優(yōu)勢
l 沒有普通抗體的輕鏈和重鏈,；
l 即用型,，節(jié)約時間,；
l 高親和力,，高載量;
應用范圍
可用于免疫沉淀（IP）/免疫共沉淀（CoIP）,、染色質免疫沉淀（ChIP）/RNA結合蛋白免疫沉淀（RIP）、酶活性測定,、質譜分析等,；
特異性
特異性結合DYKDDDDK-tag。
產品特性
存儲緩沖液：PBS(含有20%乙醇),。
保存條件：可在4℃保存1年(確保wan全密封),，或在-80℃長期保存，避免反復凍融,。
實驗步驟：
收集細胞
每個免疫沉淀反應大約使用 106-107 個表達DYKDDDDK-tag融合蛋白的細胞,，可根據DYKDDDDK-tag融合蛋白表達量適當調整細胞數。吸出培養(yǎng)基,，向培養(yǎng)皿中加入預冷的1×PBS,，漂洗2次，利用細胞刮或yi酶消化收集貼壁細胞,，細胞轉移到離心管,，500g離心3min并丟棄上清液。
植物組織裂解處理：
取適量植物組織樣本（葉片等）放置于冷凍液氮中,，之后將冷凍后得植物組織樣本放于研缽進行研磨,，盡可能充分研磨破壞其細胞壁。加入500-1000ul RIPA 裂解液（已加蛋白酶抑制劑 PMSF 等）進行裂解,，為了提高裂解效率,，加入 200ul 玻璃粉充分震蕩 30min，裂解完成后 12000 rpm,，離心 30min，吸取上清 置新的離心管中,，棄去沉淀,。
細胞裂解
1．在裂解緩沖液中加入蛋白酶抑制劑，用500μl預冷的裂解緩沖液重懸細胞,。
2．置于冰上30分鐘,，可每10分鐘充分吹打一次,。
3．4℃，20,000g離心15分鐘,，將裂解產物（上清）轉移到一個新的預冷管中,，丟棄沉淀。
注意：此時細胞裂解產物可長期保存于-80℃,。
結合蛋白
4．將20μl平衡好的DYKDDDDK-Nanoab-Agarose加入到細胞裂解產物中（可在細胞裂解產物中直接加入20μl該產品）,，于4℃旋轉混合結合1小時。根據實驗需要可調整結合時間,。如果需要,，留存50μl的裂解產物進行免疫印跡分析。
5．4℃,，2,500g離心30秒,，丟棄上清液。如果需要,，留存50μl上清液進行免疫印跡分析,。
清洗珠子
6．用500μl預冷的裂解緩沖液中重懸5中的DYKDDDDK-Nanoab-Agarose，4℃,，2,500g條件下離心30秒,，丟棄上清液并重復洗滌3次。盡量減少清洗時間,。
洗脫蛋白
方法一：
7. 加入20μl 2×SDS-sample buffer重懸DYKDDDDK-Nanoab-Agarose,。95℃，加熱10min充分變性,，2,500g離心30秒收集上清,，收集的產物可進行SDS-PAGE及免疫印跡分析。
方法二：
8. 替代步驟7的可選步驟：加入50μl 0.2M pH2.5的gan氨酸洗脫結合的蛋白,，孵育時間30秒,，期間不斷混勻，2,500g離心30秒收集上清,，立即加入5μl 1.0M Tris（pH10.4）以中和酸性的gan氨酸,。如果洗脫的蛋白含量少，可嘗試用2×DYKDDDDK-tag進行親和純化,。
注意：為了提高洗脫效率可以重復這一步,。
可選方案
方案一：
如需進行DYKDDDDK融合酶的活性檢測，無需洗脫,，可以直接檢測,。
方案二：
如需進行染色質免疫沉淀（ChIP）實驗，主要用于含有DYKDDDDK融合蛋白的蛋白質/DNA相互作用的實驗,。染色質免疫沉淀一般包括細胞固定,，染色質斷裂,，染色質免疫沉淀，聯(lián)反應的逆轉,，DNA的純化以及DNA的鑒定,。其中前期細胞固定，染色質斷裂不變,；然后接著直接進入說明書的第4步,，加入細胞裂解產物后，DNA-蛋白質復合物結合到DYKDDDDK-Nanoab-Agarose上,；
進入第5和6步,，分離得到復合物；進入第8步,，得到洗脫的復合物,；后期交聯(lián)反應的逆轉，DNA的純化及DNA的鑒定等同于普通的ChIP實驗,。RNA結合蛋白免疫沉淀（RIP）實驗步驟同上,。
方案三：
DYKDDDDK-Nanoab-Agarose 不僅可以用于在體內外檢測和驗證蛋白質之間的相互作用，也可以結合質譜分析篩選與已知蛋白相互作用的未知蛋白,。其操作步驟同免疫沉淀法,，得到洗脫的復合物后，然后進行SDS–PAGE分析,，用考馬斯亮藍或者銀染的方法染色后,，切下未知蛋白的條帶，用質譜技術鑒定未知蛋白,。
4
化工儀器網