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| 供貨周期 | 現貨 | 貨號 | GNA-50-1000 |
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GFP-Nanoab-Agarose
貨號：GNA-25-500/GNA-50-1000
儲存條件：可在4℃保存1年,，或在-80℃長期保存,，避免反復凍融。
產品描述
偶聯anti-GFP納米抗體的瓊脂糖珠子用于免疫沉淀GFP融合蛋白,。
產品優(yōu)勢
沒有普通抗體的輕鏈和重鏈,；
高親和力：解離常數達到pM級別；
高載量：10μl的slurry可以結合2-4μg GFP蛋白,；
較短的孵育時間,，結合5-30min即可；
應用范圍
可用于免疫沉淀（IP）/免疫共沉淀（CoIP）、染色質免疫沉淀（ChIP）/RNA結合蛋白免疫沉淀（RIP）,、酶活性測定,、質譜分析等；
特異性
可以結合GFP,、EGFP,、YFP和EYFP等。
產品特性
存儲緩沖液：PBS(含有20%乙醇),。
實驗步驟：
收集細胞：
每個免疫沉淀反應大約使用 106-107 個表達綠色熒光蛋白融合蛋白的細胞,，可根據綠色熒光蛋白融合蛋白表達量適當調整細胞數。吸出培養(yǎng)基,，向培養(yǎng)皿中加入預冷的1×PBS,，漂洗2次，利用細胞刮或yi酶消化收集貼壁細胞,，細胞轉移到離心管,，500g離心3分鐘并丟棄上清液。
植物組織裂解處理：
取適量植物組織樣本（葉片等）放置于冷凍液氮中,，之后將冷凍后得植物組織樣本放于研缽進行研磨,，盡可能充分研磨破壞其細胞壁。加入500-1000ul RIPA 裂解液（需加蛋白酶抑制劑）進行裂解,，為了提高裂解效率,，可加入200ul 玻璃粉充分震蕩 30min，裂解完成后12000 rpm,，離心30min,，吸取上清置新的離心管中，棄去沉淀,。
動物細胞裂解：
1．在裂解緩沖液中加入蛋白酶抑制劑,，用500μl預冷的裂解緩沖液重懸細胞。
2．置于冰上30分鐘,，可每10分鐘充分吹打一次,。
3．4℃，20,000g離心15分鐘,，將裂解產物（上清）轉移到一個新的預冷管中,，丟棄沉淀。注意：此時細胞裂解產物可長期保存于-80℃,。
平衡珠子：
4．振蕩充分混勻GFP-Nanoab-Agarose,， 吸取20μl該產品到500 μl預冷的裂解緩沖液中，4℃,，2,500g離心2分鐘,，丟棄上清液,。（此步驟可選）
結合蛋白
5．將平衡好的GFP-Nanoab-Agarose加入到細胞裂解產物中（如果未做第4步，可在細胞裂解產物中直接加入20μl該產品）,，于4℃旋轉混合結合5-30min,。如果需要，留存50μl的裂解產物進行免疫印跡分析,。
6．4℃,，2,500g離心2分鐘，丟棄上清液,。如果需要,，留存50μl上清液進行免疫印跡分析。
清洗珠子：
7．用500μl預冷的裂解緩沖液中重懸6中的GFP-Nanoab-Agarose,，4℃，2,500g條件下離心2分鐘,，丟棄上清液并重復洗滌2次,。
洗脫蛋白：
方法一：
8．加入20μl 2×SDS-sample buffer重懸GFP-Nanoab-Agarose。95℃,，加熱10min,，2,500g離心2分鐘收集上清，收集的產物可進行SDS-PAGE及免疫印跡分析,。
方法二：
9．替代步驟8的可選步驟：加入50μl 0.2 M pH2.5的gan氨酸洗脫結合的蛋白,，孵育時間30秒，期間不斷混勻,，2,500g離心2分鐘收集上清,，為了中和酸性的gan氨酸，需加入5μl 1.0 M Tris（pH10.4）,。注意：為了提高洗脫效率可以重復這一步,。
可選方案
方案一：
如需進行GFP融合酶的活性檢測，無需洗脫,，可以直接檢測,。
方案二：
如需進行染色質免疫沉淀（ChIP）實驗，主要用于含有GFP融合蛋白的蛋白質/DNA相互作用的實驗,。染色質免疫沉淀一般包括細胞固定,，染色質斷裂，染色質免疫沉淀,，交聯反應的逆轉,，DNA的純化以及DNA的鑒定。其中前期細胞固定,，染色質斷裂不變,；然后接著直接進入說明書的第5步,，加入細胞裂解產物后，DNA-蛋白質復合物結合到GFP-Nanoab-Agarose上,；
進入第6和7步,，分離得到復合物；進入第10步,，得到洗脫的復合物,；后期交聯反應的逆轉，DNA的純化及DNA的鑒定等同于普通的ChIP實驗,。RNA結合蛋白免疫沉淀（RIP）實驗步驟同上,。
方案三：
GFP-Nanoab-Agarose 不僅可以用于在體內外檢測和驗證蛋白質之間的相互作用， 也可以結合質譜分析篩選與已知蛋白相互作用的未知蛋白,。其操作步驟同免疫沉淀法,，得到洗脫的復合物后，然后進行SDS–PAGE分析,，用考馬斯亮藍或者銀染的方法染色后,，切下未知蛋白的條帶，用質譜技術鑒定未知蛋白,。
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