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LabpO Blunt快速連接試劑盒（帶T4 ligase）

產(chǎn)品貨號(hào)：P0101

儲(chǔ)存溫度：－20℃儲(chǔ)存,，6個(gè)月內(nèi)不影響使用效果,。

產(chǎn)品介紹

零背景平末端快速連接試劑盒是一種先進(jìn)的自sha基因陽(yáng)性選擇克隆系統(tǒng)，可以高效克隆平末端 PCR 產(chǎn)物和任何具有平末端的DNA片段,。該試劑盒對(duì)磷酸化或非磷酸化的DNA片段都有效,。陽(yáng)性選擇載體和插入片段連接僅需5分鐘即可獲得超過(guò)95%的陽(yáng)性重組克隆。由具有校正活性的聚合酶（如：Pfu polymerase）擴(kuò)增的平末端PCR產(chǎn)物可直接連入克隆載體,。連接產(chǎn)物可直接轉(zhuǎn)化常用的大腸桿菌菌株,。

試劑盒提供一個(gè)新穎的自sha基因陽(yáng)性選擇克隆載體pZERO-Blunt,。該載體含有致死的自sha基因（內(nèi)含多克隆位點(diǎn)）,，當(dāng)載體與片段連接成功,，自sha基因無(wú)法正確表達(dá)，包含重組子的細(xì)胞可以正常生長(zhǎng),；當(dāng)載體與片段連接不成功,，載體自連后自sha基因正確表達(dá)，包含自連空載體的細(xì)胞無(wú)法存活,，即零背景,。這種陽(yáng)性篩選策略無(wú)需藍(lán)白斑篩選，極大地加速了克隆篩選進(jìn)程,。

為方便酶切作圖和插入片段基因操作,，pZERO-Blunt克隆載體的多克隆位點(diǎn)兩側(cè)各包含一個(gè)BglII識(shí)別序列。此外,，該載體含有T7啟動(dòng)子,，可用于體內(nèi)或體外轉(zhuǎn)錄、插入片段測(cè)序等研究,。

操作步驟

1.連接反應(yīng)的準(zhǔn)備：

平末端PCR產(chǎn)物或者酶切后平末端片段可以通過(guò)瓊脂糖凝膠電泳分離回收（使用長(zhǎng)波紫外光

下切膠或者可見光透射切膠避免DNA損傷造成連接失?。Ｅc載體的摩爾比是3:1,。

2.連接反應(yīng)：

1) 在一個(gè)標(biāo)準(zhǔn)的10ul連接反應(yīng)體系中,，加入1ul 40ng pZERO-Blunt載體、X ul PCR產(chǎn)物(在通常狀況下,，沒有必要對(duì)PCR產(chǎn)物進(jìn)行精確定量,，一般PCR產(chǎn)物與載體的摩爾比優(yōu)化至1:1~10:1就可以得到良好結(jié)果，推薦3:1,，見附錄),、5ul 2×Quick ligation Buffer 和0.9ul的T4 DNA Ligase，其余用滅菌水補(bǔ)足,。

反應(yīng)按以下體系進(jìn)行：

一般最后加入T4 DNA Ligase,。

2)22℃連接5-10分鐘（一般可在PCR儀器完成）。

通常推薦 22℃連接5-10分鐘 ,，>3kb 長(zhǎng)片段連接可以延長(zhǎng)至30分鐘,。不推薦超過(guò)30分鐘，超過(guò)可能降低轉(zhuǎn)化子數(shù)量,。

3)冰上冷卻,，然后轉(zhuǎn)化或貯存于-20℃。

3.轉(zhuǎn)化：

1)100ul感受態(tài)細(xì)胞,，置于冰上,，*解凍后輕撣幾次將細(xì)胞均勻懸浮。

2)加入4－5ul連接液(最多可全部加入，只要連接液體積不超過(guò)感受態(tài)細(xì)胞體積的1/10),，輕輕混勻,。冰上放置30分鐘。

3)42℃水浴熱激90秒,。冰上放置2~3 分鐘,。

4)加500ulLB 或者SOC 培養(yǎng)基(不含抗生素)，37℃ 150rpm 振蕩培養(yǎng)60分鐘,。

5)將200ul細(xì)菌涂布在氨芐青mei素(100µg/ml)平板上,。

涂布細(xì)菌的用量依連接的效率及感受態(tài)細(xì)胞的感受率而進(jìn)行適當(dāng)?shù)恼{(diào)整，如果預(yù)計(jì)的克隆較少,，可通過(guò)離心（4,000rpm,，2分鐘）后吸除部分培養(yǎng)液，留下適量的培養(yǎng)基懸浮菌體后取全部或者適量涂布于一個(gè)平板中（涂布剩余的菌液可以放4度保存,，第2天如果轉(zhuǎn)化菌落數(shù)量少,，可將剩余菌液全部涂一個(gè)新培養(yǎng)板)。

6)平板在37℃下正向放置 1小時(shí)以吸收過(guò)多的液體,，然后倒置培養(yǎng)過(guò)夜,。

4.轉(zhuǎn)化子的篩選鑒定：

1) 常規(guī)檢測(cè)：將得到的菌落接種1-5ml LB（含有終濃度為100µg/ml的氨芐青mei素）培養(yǎng)基，37℃搖床振蕩培養(yǎng)過(guò)夜,，保存菌種后提取質(zhì)粒,，應(yīng)用PCR或酶切方法鑒定插入片段是否正確。

2) 快速檢測(cè)：挑取菌落直接進(jìn)行PCR檢測(cè)（可參見分子克隆第3版本）,。

3) 測(cè)序鑒定：使用試劑盒自帶引物或者T7啟動(dòng)子引物測(cè)序來(lái)確定是否含有目的克隆,。

試劑盒自帶測(cè)序引物（暨菌落PCR引物）：

附錄：

如何計(jì)算連接反應(yīng)中需要的PCR 產(chǎn)物的量 ?

一般PCR產(chǎn)物與載體的摩爾比優(yōu)化至1:1~10:1（推薦3:1）就可以得到良好結(jié)果，可采用以下公式：

[加入載體的量（ng）×插入片段大?。╧b）÷載體大?。╧b）]×插入片段和載體的摩爾比=插入片段的量（ng） 例如：插入片段和載體連接的摩爾比例為3:1，如連接反應(yīng)中加入載體40ng,，插入片段大小為500bp,，這時(shí)應(yīng)加入插入片段的量為[40ng載體×0.5kb插入片段÷2.974kb載體]×3/1=20.2ng。

pZERO-Blunt 載體圖譜:

pZERO-Blunt 載體克隆位點(diǎn)序列: