Western blot，也稱Western blotting,、Western印跡,，常簡(jiǎn)寫為WB，是用抗體檢測(cè)蛋白表達(dá)的重要方法之一,。WB步驟操作如下：
一,、 蛋白樣品處理
1、裂解液的選擇
根據(jù)蛋白在細(xì)胞中的位置選擇合適的裂解液,，例如RIPA強(qiáng)(R1091)用于核蛋白及膜蛋白的提取,、RIPA中（R1090）用于胞漿蛋白的提取,、而RIPA弱或者western專用裂解液（W0013）適用于較好提取的蛋白；
對(duì)于某些特定的亞細(xì)胞組份蛋白,，例如細(xì)胞核蛋白,、細(xì)胞漿蛋白、線粒體蛋白等,，可以參考相關(guān)文獻(xiàn)提取這些亞細(xì)胞組份蛋白,，也可以使用試劑盒進(jìn)行抽提
2、抑制蛋白降解
為防止蛋白的降解,，需要添加蛋白酶抑制劑,、磷酸酶抑制劑等。例如LABLEAD的蛋白酶抑制劑cocktail（C0101）是一種廣譜型的抑制劑,，由六種成分配置成的溶液，可適用于蛋白純化,，western,，IP等各種實(shí)驗(yàn)。
如研究磷酸化蛋白,，為保持蛋白的穩(wěn)定,，可使用磷酸蛋白酶酶抑制劑（C0104）。
3,、蛋白定量：
收集完蛋白樣品后,，為確保每個(gè)蛋白樣品的上樣量一致，需要測(cè)定每個(gè)蛋白樣品的蛋白濃度,。根據(jù)所使用的裂解液的不同,，需要采用適當(dāng)?shù)牡鞍诐舛葴y(cè)定方法。不同的蛋白濃度測(cè)定方法對(duì)于一些去垢劑和還原劑等的兼容性差別很大,。
如果使用LABLEAD的裂解液(R1091,、R1090、W0013),，可使用BCA蛋白濃度測(cè)定試劑盒(B5001),、Bradford蛋白濃度測(cè)定試劑盒(去垢劑兼容型)(B5106)。
如自己配置裂解液,，其中含有triton x-100,、SDS等去污劑時(shí)，推薦使用BCA蛋白濃度測(cè)定試劑盒(B5001),；如溶液中含有EDTA,、DTT等還原劑時(shí)推薦使用Bradford蛋白濃度測(cè)定試劑盒（B5105）
二、電泳
1,、SDS-PAGE凝膠配制
SDS-PAGE凝膠分幾種配置的方式,，如需自行配置可購(gòu)買制膠液,，如30%制膠液（A3291）、4*SDS濃縮膠緩沖液（S4880）,、4*SDS分離膠緩沖液（S4680）,，也可使用LABLEAD生產(chǎn)的SDS-PAGE凝膠配制試劑盒(P1050M)、SDS-PAGE凝膠快速配制試劑盒(P0105),。兩種試劑盒提供了除水和配膠器具外的所有試劑以及配制各種濃度SDS-PAGE的配方,。
如需更方便的電泳，可使用LABLEAD的各種濃度規(guī)格的預(yù)制膠產(chǎn)品(P00812/P00815/P01012/P01015/P01212/P01215/P41212/P41215/P42012/P42015),。
2,、樣品處理
在收集的蛋白樣品中加入適量濃縮的SDS-PAGE蛋白上樣緩沖液。例如4X或5X的SDS-PAGE蛋白上樣緩沖液,。使用5X的SDS-PAGE蛋白上樣緩沖液可以減小上樣體積,，在相同體積的上樣孔內(nèi)可以上樣更多的蛋白樣品。5X的SDS-PAGE蛋白上樣緩沖液可以參考相關(guān)文獻(xiàn)資料配制,，推薦LABLEAD的蛋白上樣緩沖液(4X)(G2526)或 蛋白上樣緩沖液(5X) (G2527),。
如果是非變性樣品，可以使用非變性非還原性蛋白上樣緩沖液(G2621),。
樣品處理時(shí)可按照100℃或沸水浴加熱3-5min,，或者95℃ 加熱10min，以充分變性蛋白,。如使用預(yù)制膠,，可適當(dāng)延長(zhǎng)樣品處理的時(shí)間。
3,、上樣與電泳
蛋白樣品冷卻到室溫后,，直接上樣到SDS-PAGE膠加樣孔內(nèi)即可。
LABLEAD提供各種預(yù)染蛋白質(zhì)分子量標(biāo)準(zhǔn)用于觀察電泳效果和轉(zhuǎn)膜效果,，以及判斷蛋白分子量大小,。最好使用彩色預(yù)染蛋白質(zhì)分子量標(biāo)準(zhǔn)(P1017/P1018/P1025/P10310)。
電泳液推薦使用蘭博利德生產(chǎn)的SDS-PAGE電泳液(T7777),，或者可以長(zhǎng)期儲(chǔ)存的速溶顆粒產(chǎn)品（T7206M）,。
電泳時(shí)推薦在上層膠時(shí)使用低電壓恒壓電泳，當(dāng)溴酚藍(lán)進(jìn)入下層膠時(shí)使用高電壓恒壓電泳,。對(duì)于Bio-Rad的標(biāo)準(zhǔn)電泳裝置或類似電泳裝置,，低電壓可以設(shè)置在80-100V，高電壓可以設(shè)置在120V左右,。SDS-PAGE可以采用普通的電泳儀就可以滿足要求,。為了方便起見，也可以采用整個(gè)SDS-PAGE過(guò)程恒壓的方式，通常把電壓設(shè)置在100V,，然后設(shè)定定時(shí)時(shí)間為90-120分鐘,。設(shè)置定時(shí)可避免發(fā)生電泳過(guò)頭的情況。
當(dāng)溴酚藍(lán)到達(dá)膠的底端處附近即可停止電泳,，或可根據(jù)預(yù)染蛋白質(zhì)分子量標(biāo)準(zhǔn)的電泳情況,，預(yù)計(jì)目的蛋白已經(jīng)被適當(dāng)分離后即可停止電泳。
三,、 轉(zhuǎn)膜(Transfer)
推薦在Western實(shí)驗(yàn)中選用PVDF膜,，優(yōu)先推薦使用PVDF膜，如蛋白分子量大于20KD推薦使用(進(jìn)口分裝,，13.25*15cm,0.45μm) (IPVH00010-1),，蛋白分子量小于20KD推薦使用(進(jìn)口分裝，13.25*15cm,0.45μm) (ISEQ00010-1),。PVDF膜在使用前須經(jīng)甲醇浸潤(rùn)和活化,。也可使用硝酸纖維素膜(NC膜)，但硝酸纖維素膜比較脆,，在操作過(guò)程中特別是用鑷子夾取等過(guò)程中容易裂開,。
轉(zhuǎn)膜推薦使用bio-rad的預(yù)裁轉(zhuǎn)印濾紙(7.5×250px) (cat：1703932)，吸水性強(qiáng),，不掉屑。
轉(zhuǎn)膜溶液推薦使用LABLEAD的10X轉(zhuǎn)膜緩沖液(T3011),，需要在稀釋是添加20%的甲醇,，以提高轉(zhuǎn)膜效率。出于安全性,、省事性的考慮LABLEAD還有使用乙醇配置的轉(zhuǎn)膜緩沖液,，20x快速轉(zhuǎn)膜緩沖液（T3012）
通常濕式轉(zhuǎn)膜方式，可以設(shè)定轉(zhuǎn)膜電流為300-400mA,，轉(zhuǎn)膜時(shí)間為30-60分鐘,。也可以在15-20mA轉(zhuǎn)膜過(guò)夜。具體的轉(zhuǎn)膜時(shí)間要根據(jù)目的蛋白的大小而定,，目的蛋白的分子量越大,，需要的轉(zhuǎn)膜時(shí)間越長(zhǎng)，目的蛋白的分子量越小,，需要的轉(zhuǎn)膜時(shí)間越短,。
如使用伯樂(lè)的Turbo系統(tǒng)進(jìn)行半干轉(zhuǎn)時(shí)，在使用伯樂(lè)配套的轉(zhuǎn)膜緩沖液（）時(shí),，則可參考以下轉(zhuǎn)膜條件：2.5A恒流,，限壓25V，3-5min即可完成轉(zhuǎn)膜。
在轉(zhuǎn)膜過(guò)程中,，特別是高電流快速轉(zhuǎn)膜時(shí),，通常會(huì)有非常嚴(yán)重的發(fā)熱現(xiàn)象，最好把轉(zhuǎn)膜槽放置在冰浴中進(jìn)行轉(zhuǎn)膜,。
轉(zhuǎn)膜的效果可參考所使用的預(yù)染蛋白質(zhì)分子量標(biāo)準(zhǔn),，其中分子量最大的1-2條帶較難全部轉(zhuǎn)到膜上。轉(zhuǎn)膜的效果也可以用麗春紅染色液對(duì)膜進(jìn)行染色,，用于觀察實(shí)際的轉(zhuǎn)膜效果,。也可用免脫色考馬斯亮藍(lán)快速染色液(G1042)對(duì)完成轉(zhuǎn)膜的蛋白膠進(jìn)行染色，用于檢測(cè)轉(zhuǎn)膜的效果,。
四,、封閉(Blocking)
轉(zhuǎn)膜結(jié)束后，將蛋白膜放置到預(yù)先加入了清水的孵育盒（FYH01-1）中,，漂洗1-2分鐘,，洗去膜上的轉(zhuǎn)膜液。轉(zhuǎn)膜結(jié)束后的所有步驟,，要注意膜的保濕,，避免膜的干燥，否則很容易產(chǎn)生較高的背景,。
倒掉洗膜后的液體,，推薦加入適量的快速封閉液(P0203)，在搖床上緩慢搖動(dòng),，室溫封閉20-30分鐘,；也可以加入用脫脂奶粉（N7861）配置的5%的溶液作為封閉液，在搖床上緩慢搖動(dòng),，室溫封閉60分鐘或者4度過(guò)夜,。對(duì)于一些背景較高的抗體，兩種封閉液都可以適當(dāng)延長(zhǎng)封閉時(shí)間,，如有必要甚至可以4℃封閉過(guò)夜,。
五、一抗孵育
參考一抗的說(shuō)明書,，按照適當(dāng)比例用一抗稀釋液(D0151)稀釋一抗,。一抗也可以用TBST溶液或者配置好的封閉液稀釋，但是為了延長(zhǎng)一抗的使用時(shí)間,，推薦用一抗稀釋液,。
收集封閉液，然后加入稀釋好的一抗,，室溫或4℃在側(cè)擺搖床上緩慢搖動(dòng)孵育一小時(shí),。如果一抗孵育一小時(shí)效果不佳，可以4℃緩慢搖動(dòng)孵育過(guò)夜。也可根據(jù)抗體的說(shuō)明選擇適當(dāng)?shù)姆跤郎囟群蜁r(shí)間,。
回收一抗,。加入TBST緩沖液(T9039)洗去未結(jié)合的一抗，在側(cè)擺搖床上緩慢搖動(dòng)洗滌5-10分鐘,。吸盡洗滌液后,，再加入洗滌液洗滌5-10分鐘。共洗滌3次,。如果結(jié)果背景較高可以適當(dāng)延長(zhǎng)洗滌時(shí)間并增加洗滌次數(shù),。
Western結(jié)果通常需要提供內(nèi)參作為對(duì)照，可以選用Tubulin抗體(T0100),、Actin抗體(A0101)或GAPDH抗體(G0100),，進(jìn)行內(nèi)參檢測(cè)。
六,、二抗孵育
參考二抗的說(shuō)明書選擇辣根過(guò)氧化物酶(HRP)等標(biāo)記的二抗,。二抗需根據(jù)一抗進(jìn)行選擇，例如,，一抗是小鼠來(lái)源的IgG,，則二抗需選擇抗小鼠IgG的二抗，如山羊抗小鼠IgG-HRP(H+L)(S0100),。
加入稀釋好的二抗,，室溫或4℃在側(cè)擺搖床上緩慢搖動(dòng)孵育一小時(shí)。
回收二抗,，在側(cè)擺搖床上緩慢搖動(dòng)洗滌5-10分鐘,，重復(fù)洗滌3次。如果結(jié)果背景較高可以適當(dāng)延長(zhǎng)洗滌時(shí)間并增加洗滌次數(shù),。
七、顯影檢測(cè)
使用LABLEAD ECL發(fā)光液來(lái)檢測(cè)蛋白,，ECL發(fā)光液 普通款（E1050）一般使用暗室曝光時(shí)可推薦此款,。如需更靈敏的發(fā)光液，推薦使用 ECL 超敏發(fā)光液（E1060）,，和ECL 超敏發(fā)光液M（E1070,，和millipore WBKLS0100同級(jí)別）；如蛋白豐度極低時(shí)推薦使用 ECL超敏發(fā)光液(femto)（E1080）,。
八,、膜的重復(fù)利用
如果蛋白樣品很寶貴，可使用膜再生液(M0500)處理蛋白膜,，以重復(fù)利用蛋白膜,。再次重生使用的膜需要重新封閉后孵育新的二抗。
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