腫瘤免疫治療旨在激活宿主的抗腫瘤免疫,，形成腫瘤抑制微環(huán)境,，最終實現(xiàn)消除腫瘤，提高患者的整體生存率,。腫瘤疫苗是一種很有前途的抗腫瘤免疫治療手段,。針對腫瘤相關(guān)抗原（TAAs）或腫瘤特異性抗原（TSAs）的疫苗可以特異性攻擊和摧毀這些抗原高水平表達的惡性腫瘤細胞，并通過免疫記憶實現(xiàn)持續(xù)的腫瘤殺傷,。因此,，與其他類型的免疫治療相比，癌癥疫苗理論上可以提供特異,、安全和耐受性良好的治療效果,。
基于mRNA的核酸疫苗是在30多年前提出的，mRNA疫苗比傳統(tǒng)疫苗有許多優(yōu)點：與某些病毒疫苗不同,，mRNA不會整合到基因組中,，從而避免了對插入突變的擔憂；mRNA疫苗可以以無細胞的方式制造,，從而實現(xiàn)快速,、經(jīng)濟、高效的生產(chǎn),。此外,，單個mRNA疫苗可以編碼多種抗原,，增強針對適應(yīng)性病原體的免疫反應(yīng)，并能夠以單一配方針對多種微生物或病毒變體,。
mRNA疫苗是一類重要的癌癥疫苗,，能夠編碼和表達TAA、TSA及其相關(guān)細胞因子,。mRNA癌癥疫苗可以刺激體液免疫和細胞免疫,，提高這些疫苗對不同疾病和患者的適應(yīng)性。目前,，多種mRNA癌癥疫苗正在臨床中進行開發(fā),，為癌癥免疫治療帶來新的曙光。
體外轉(zhuǎn)錄（IVT）mRNA模擬內(nèi)源性mRNA的結(jié)構(gòu),，有五個部分,，從5?到3?包括：5?cap，5?非翻譯區(qū)（UTR）,，一個編碼抗原的開放閱讀框,，3?UTR和一個PolyA尾。
與天然真核mRNAs一樣,，5′端帽結(jié)構(gòu)包含一個7-甲基鳥苷核苷,，5′端結(jié)構(gòu)會在空間上保護mRNA不被核酸外切酶降解，并與翻譯起始因子蛋白協(xié)同工作,，招募核糖體以啟動翻譯,。PolyA尾的長度間接調(diào)節(jié)mRNA翻譯和半衰期。
編碼區(qū)兩側(cè)的5′和3′UTR調(diào)節(jié)mRNA翻譯,、半衰期和亞細胞定位,，來自高表達基因（如α-和β-珠蛋白基因）的天然UTR是合成mRNAs的選擇。此外,，UTR可根據(jù)細胞類型進行優(yōu)化,，如通過去除3′UTR中的miRNA結(jié)合位點和富含AU的區(qū)域，將mRNA降解降至,。
mRNA疫苗的開放閱讀框是最關(guān)鍵的組成部分,，盡管開放閱讀框不像非編碼區(qū)那樣具有可塑性，但可以通過優(yōu)化密碼子,，從而在不改變蛋白質(zhì)序列的情況下增加翻譯,。例如，CureVac AG公司發(fā)現(xiàn)人類mRNA密碼子很少在第三位有A或U,，從而用G或C替換開放閱讀框第三位的A或U,。并將此優(yōu)化策略用于其SARS-CoV-2疫苗CVnCoV，目前正處于III期試驗階段,。
為了翻譯,，mRNA序列通常包含修飾的核苷,，例如假尿苷、N1-甲基假尿苷或其他核苷類似物,。修飾核苷的使用,，特別是修飾尿苷，阻止了模式識別受體的識別,，保證了翻譯過程產(chǎn)生足夠水平的蛋白質(zhì),。Moderna和Pfizer–BioNTech SARS-CoV-2疫苗都含有核苷修飾。另一種避免模式識別受體檢測的策略,，使用序列工程化和密碼子優(yōu)化,，通過提高疫苗mRNA的GC含量來消耗尿苷。
除了mRNA序列的改進外,，在簡化mRNA生產(chǎn)方面也取得了重大進展,。臨床上使用的合成mRNA通過使用噬菌體RNA聚合酶T7（也可以使用T3和SP6聚合酶）從DNA質(zhì)粒在體外轉(zhuǎn)錄。另外,，使用CleanCap的共轉(zhuǎn)錄封蓋技術(shù)，簡化了純化步驟,。
由于mRNA較大（104–106Da）且?guī)ж撾?，因此無法通過細胞膜的陰離子脂質(zhì)雙層。此外,，在體內(nèi),，它會被先天免疫系統(tǒng)的細胞吞噬，并被核酸酶降解,。因此,，體內(nèi)應(yīng)用需要使用mRNA遞送載體，該載體轉(zhuǎn)染免疫細胞而不會引起毒性或不必要的免疫原性,。目前,，已經(jīng)為此開發(fā)了許多基于創(chuàng)新材料的解決方案。
脂質(zhì)納米顆粒（LNP）
脂質(zhì)納米顆粒是臨床上先進的mRNA載體,。截至2021年6月,，所有正在研制或批準臨床使用的SARS-CoV-2 mRNA疫苗均采用LNPs。LNP為mRNA遞送提供了許多好處,，包括制劑簡單,、模塊化、生物相容性和較大的mRNA有效載荷容量,。除RNA藥物外,，LNP通常包括四種成分，可電離脂質(zhì),、膽固醇,、輔助磷脂和聚乙二醇化脂質(zhì),，它們共同封裝和保護脆弱的mRNA。
可電離脂質(zhì)與mRNA在酸性緩沖液中形成納米顆粒,，使脂質(zhì)帶正電荷并吸引RNA,。此外，它們在內(nèi)涵體的酸性環(huán)境中帶正電荷,，這促進了它們與內(nèi)涵體膜的融合,，將其釋放到細胞質(zhì)中。
DODAP和DODMA是第一種用于RNA輸送的可電離脂質(zhì),。通過設(shè)計提高DODMA的功效,，產(chǎn)生了DLin-MC3-DMA。這是第一個FDA批準的藥物制劑中使用的可電離脂質(zhì)：siRNA藥物patisiran（Onpattro）,。除了有效且安全地遞送siRNA外,，DLin-MC3-DMA還用于mRNA的遞送。
目前,，學(xué)術(shù)界和工業(yè)界的許多團體使用組合反應(yīng)方案來合成潛在的傳遞材料,，這種方法產(chǎn)生了許多有效的脂質(zhì)，包括C12-200,、503O13,、306Oi10、OF-02,、TT3,、5A2-SC8、SM-102（用于抗SARS-CoV-2的Moderna疫苗mRNA-1273）和ALC-0315（用于輝瑞疫苗BNT162b2）,。
除了尋求提高療效外,，人們越來越關(guān)注提高藥物的特異性，特別是對疫苗和免疫療法的特異性,。含有多環(huán)金剛烷尾的脂質(zhì)11-A-M58,，和含有環(huán)咪唑頭的脂質(zhì)93-O17S59，已被設(shè)計用于體內(nèi)靶向T細胞,。盡管機制尚不清楚,，但這些脂質(zhì)的環(huán)狀基團對于靶向T細胞至關(guān)重要。
盡管電離脂質(zhì)可以說是LNP最重要的成分,，但其他三種脂質(zhì)成分（膽固醇、輔助脂質(zhì)和聚乙二醇化脂質(zhì)）也促進了納米粒子的形成和功能,。膽固醇是一種天然存在的脂質(zhì),，它通過填充脂質(zhì)之間的空隙來增強納米顆粒的穩(wěn)定性，并有助于在攝取到細胞的過程中與內(nèi)涵體膜融合,。
輔助脂質(zhì)通過促進有助于膜與內(nèi)涵體融合的脂質(zhì)相變來調(diào)節(jié)納米顆粒的流動性并增強功效,。最佳輔助脂質(zhì)的選擇取決于可電離脂質(zhì)材料和RNA載體,。例如，對于類脂質(zhì)材料,，飽和輔助脂質(zhì)（如DSPC）適合傳遞短RNA（如siRNA），而不飽和脂質(zhì)（如DOPE）適合傳遞mRNA ,。DSPC已被用于FDA批準的SARS-CoV-2疫苗mRNA-1273和BNT162b2中,。
LNPs的聚乙二醇化脂質(zhì)成分由聚乙二醇（PEG）與錨定脂質(zhì)（如DMPE或DMG）結(jié)合而成。親水性PEG可以穩(wěn)定LNP,，通過限制脂質(zhì)融合調(diào)節(jié)納米顆粒大小,，并通過減少與巨噬細胞的非特異性相互作用增加納米顆粒半衰期。mRNA-1273和BNT162b2 SARS-CoV-2疫苗均含有聚乙二醇化脂質(zhì),。
聚合物和聚合物納米顆粒
盡管臨床進展不如LNP,，但聚合物具有與脂質(zhì)相似的優(yōu)勢，能夠有效傳遞mRNA,。陽離子聚合物將核酸濃縮成具有不同形狀和大小的復(fù)合物,，可通過內(nèi)吞作用進入細胞,。
聚乙烯亞胺是研究廣泛的核酸傳遞聚合物,。盡管其功效，但由于其高電荷密度,，其毒性限制了應(yīng)用,。此外，已經(jīng)開發(fā)出幾種毒性較小的可生物降解聚合物,。例如,，聚（β-氨基酯）在mRNA傳遞方面表現(xiàn)出色，尤其是對肺,。
最近開發(fā)出了一種新型的含脂聚合物,，稱為電荷改變可釋放轉(zhuǎn)運體（CARTs），它能有效地靶向T細胞,，操縱T細胞是非常困難的,，因此，CART 是一種有吸引力的傳遞材料,，在mRNA疫苗和基因治療領(lǐng)域具有巨大潛力,。
其他遞送系統(tǒng)
除了脂質(zhì)和聚合物載體外,，肽也可以將mRNA傳遞到細胞中，這要歸功于其主鏈和側(cè)鏈中的陽離子或兩親胺基（例如精氨酸）,，這些陽離子或兩親胺基與mRNA靜電結(jié)合并形成納米復(fù)合物,。例如，含有重復(fù)的精氨酸-丙氨酸-亮氨酸-丙氨酸（RALA）基序的膜融合細胞穿透肽,。
富含精氨酸的魚精蛋白肽在中性pH下帶正電荷,，也可以濃縮mRNA并促進其傳遞。魚精蛋白與mRNA復(fù)合物激活識別單鏈mRNA的Toll樣受體（TLR7,，TLR8）通路,，因此，它還可以作為疫苗或免疫治療應(yīng)用的佐劑,。CureVac AG正在評估一種含有魚精蛋白的遞送平臺RNActive,，用于黑色素瘤、前列腺癌和非小細胞肺癌的臨床試驗,。
最后,，基于角鯊烯陽離子納米乳液也可以傳遞mRNA，這些納米乳劑由油性角鯊烯核組成,。一些角鯊烯制劑,，如諾華的MF59，在FDA批準的流感疫苗中用作佐劑,。MF59使注射部位的細胞分泌趨化因子,，從而招募抗原呈遞細胞，誘導(dǎo)單核細胞分化為樹突狀細胞,，并增強抗原呈遞細胞對抗原的攝取,。角鯊烯基陽離子納米乳劑從內(nèi)涵體逃逸并將mRNA輸送到細胞質(zhì)中的機制尚不清楚。
在注射mRNA癌癥疫苗后,，mRNA編碼的蛋白質(zhì)由核糖體合成,，然后翻譯后修飾以產(chǎn)生正確折疊的功能蛋白質(zhì)，并呈現(xiàn)給免疫系統(tǒng),。該過程類似于RNA病毒感染和連續(xù)誘導(dǎo)保護性免疫反應(yīng)的自然過程,。外源mRNA進入細胞質(zhì)導(dǎo)致與內(nèi)源性mRNA類似的反應(yīng)。
誘導(dǎo)先天免疫反應(yīng)
宿主免疫系統(tǒng)通過PRRs檢測病原體相關(guān)分子模式（PAMP）激活固有免疫反應(yīng),。注射疫苗后,，mRNA和傳遞系統(tǒng)成分將通過一系列PRR識別為外源性物質(zhì)，導(dǎo)致Toll樣受體（TLR）的激活,，例如主要在抗原呈遞細胞（APC）上表達的TLR3,、TLR7和TLR8。外源性IVT mRNA可被細胞膜、內(nèi)體以及細胞質(zhì)中的各種PRR識別,，并在刺激內(nèi)源性免疫反應(yīng)中發(fā)揮作用,。
IVT mRNA的免疫原性主要由TLR7和TLR8介導(dǎo)。TLR7由B細胞,、巨噬細胞和樹突狀細胞表達,，并介導(dǎo)識別單鏈RNA（ssRNA）的過程。在細胞質(zhì)中,，其他一些PRR可以感應(yīng)不同類型的RNA,，例如dsRNA和ssRNA。
在非免疫細胞中,，細胞質(zhì)維甲酸誘導(dǎo)基因I樣受體（RLR）和黑色素瘤分化相關(guān)基因5（MDA5）感應(yīng)外源mRNA并調(diào)節(jié)細胞因子和趨化因子的產(chǎn)生,，導(dǎo)致天然免疫細胞募集到mRNA注射部位。
誘導(dǎo)適應(yīng)性免疫反應(yīng)
mRNA疫苗接種后,，編碼的蛋白質(zhì)將被翻譯并呈遞給免疫系統(tǒng),，并刺激適應(yīng)性免疫。mRNA編碼的蛋白質(zhì)通過內(nèi)吞或吞噬作用被APC吸收,，它們可能形成吞噬小泡或含有抗原蛋白的內(nèi)體,，抗原蛋白通過樹突狀細胞上的主要組織相容性復(fù)合體呈遞。
mRNA癌癥疫苗通常編碼在癌細胞上表達的TAA,。這些TAA可進一步分為組織分化抗原（如MART-1）,、腫瘤生殖系抗原（如NY-ESO-1或MAGE-3）、腫瘤細胞過表達的正常蛋白（如EGFR,、MUC1,、Her2/neu）、病毒蛋白（如EBV,、HPV）和腫瘤特異性突變抗原（如MUM-1,、β-catenin或CDK4）。此外,，體細胞突變可能產(chǎn)生新抗原表位,，碼新抗原的mRNA疫苗被認為是最佳的候選癌癥疫苗,。
除了誘導(dǎo)T細胞免疫外,，mRNA疫苗還誘導(dǎo)中和抗體。濾泡輔助性T細胞（Tfh）不僅對生發(fā)中心的發(fā)育至關(guān)重要,，而且還驅(qū)動免疫球蛋白樣轉(zhuǎn)化,、親和力成熟和持久的B細胞記憶反應(yīng)。這些細胞可以被mRNA疫苗激活,，產(chǎn)生足夠數(shù)量有效和持久的中和抗體,。
基于IVT mRNA的疫苗正在逐步開發(fā)，用于多種腫瘤治療。目前,，mRNA癌癥疫苗根據(jù)最終產(chǎn)品類型可以分為編碼TAA,、TSA、細胞因子和抗體的癌癥疫苗,。
編碼TAAs 的mRNA疫苗
在多項臨床試驗中,，NY-ESO-1、酪氨酸酶,、MAGE-A3,、MAGE-C2和TPTE已被用作黑色素瘤mRNA疫苗的TAA。
BNT111是一種BioNTech FixVac平臺開發(fā)癌癥疫苗,，該平臺利用TAA的固定組合,，旨在觸發(fā)針對癌癥的強大而精確的免疫反應(yīng)。2021年底,，F(xiàn)DA批準了BNT111快速通道資格,，這是一種治療晚期黑色素瘤的新型癌癥免疫療法，目前BNT111正在兩項臨床試驗中進行研究,。一項I期試驗（NCT02410733）的中期分析報告表明,，BNT111是有效的免疫療法。隨后的II期試驗（NCT04526899）研究BNT111單獨或與抗PD-1抗體cemiplimab聯(lián)合的安全性和有效性,。
CV9201和CV9202是兩種針對非小細胞肺癌中表達的靶抗原的mRNA疫苗,。臨床試驗（NCT00923312、NCT01915524,、NCT03164772）表明,，這兩種疫苗耐受性良好，治療后可以檢測到免疫反應(yīng),，從而支持在非小細胞肺癌中的進一步臨床研究,。
編碼TSA的mRNA疫苗
編碼多種突變抗原的mRNA疫苗是治療突變誘發(fā)的惡性腫瘤的理想疫苗，這種類型的癌癥疫苗進行的臨床試驗最多,。隨著下一代測序技術(shù)的發(fā)展,，可以生產(chǎn)編碼突變抗原的個性化mRNA癌癥疫苗，這種個性化的癌癥疫苗具有非常誘人的前景,。
兩種個性化mRNA癌癥疫苗目前正在進行二期臨床試驗,，即Moderna的mRNA-4157和BioNTech的BNT122（RO7198457）。mRNA-4157在單個mRNA分子上特異性篩選和編碼20-34個新抗原,，這取決于患者的癌癥突變,。一期試驗（NCT03313778）的中期數(shù)據(jù)表明，mRNA-4157單藥治療或與PD-1抑制劑Keytruda聯(lián)合治療在所有測試劑量下都具有良好的耐受性,，并引發(fā)新抗原特異性T細胞反應(yīng),。該疫苗目前正在黑色素瘤患者進行二期臨床試驗（NCT03897881）,。BioNTech 的BNT122已經(jīng)探索了與PD-L1抗體聯(lián)合治療的有效性和安全性，在黑色素瘤,、非小細胞肺癌和大腸癌的II期臨床試驗已于2021上半年啟動,。
mRNA編碼免疫刺激劑
理論上，mRNA癌癥疫苗可以編碼任何蛋白質(zhì),，包括免疫刺激劑,，其可以重塑腫瘤免疫微環(huán)境（TIME），克服腫瘤免疫耐受,，這已成為mRNA腫瘤疫苗研究的一個重要方向,。
在過去幾年中，已經(jīng)進行了編碼細胞因子的mRNAs癌癥疫苗的臨床試驗,。目前,，臨床試驗中只有七種候選產(chǎn)品，它們屬于Moderna和BioNTech,。2017年,，Moderna開發(fā)了第一個表達mRNA編碼的免疫刺激劑（mRNA-2416），其編碼OX40L,，一項1期臨床試驗（NCT03323398）評估了mRNA-2416單獨和與durvalumab聯(lián)合的安全性和耐受性,。已有的數(shù)據(jù)表明，mRNA-2416單藥在所有劑量水平下都是可耐受的,，沒有報告劑量限性,，大多數(shù)相關(guān)不良事件為1級或2級。更重要的是,，在PD-L1上調(diào)的時間內(nèi)觀察到廣泛的促炎活性和有益的變化,。目前，mRNA-2416瘤內(nèi)注射已進入晚期卵巢癌的臨床II期試驗,。
另一種mRNA疫苗mRNA-2752編碼OX40L/IL23/IL36γ,，早期的臨床結(jié)果表明，mRNA-2752與抗PD-L1抗體durvalumab聯(lián)合使用,，在所有劑量下都具有良好的耐受性,，并顯示出抗腫瘤活性的跡象。
此外,，BioNTech還開發(fā)了編碼IL-12sc,、IL-15sushi、GM-CSF和IFNα的BNT131,，其作為單一療法或與cemiplimab聯(lián)合用于晚期實體瘤患者,。
幾十年來,，mRNA設(shè)計和核酸遞送技術(shù)的進步,，加上新抗原靶點的發(fā)現(xiàn)，使得mRNA疫苗成為對抗癌癥的有力工具。mRNA疫苗的優(yōu)勢體現(xiàn)在mRNA癌癥疫苗具有同時編碼多種抗原的能力,，以及非整合,、高度降解和無插入突變潛力。IVT產(chǎn)生的mRNA不含細胞和致病性病毒成分,，沒有感染的可能性,；在正在進行的臨床試驗中測試的大多數(shù)mRNA疫苗通常耐受性良好，注射部位特異性免疫反應(yīng)很少,。
快速生產(chǎn)是mRNA癌癥疫苗的另一個優(yōu)勢,，并且mRNA制造技術(shù)的成熟允許在短時間內(nèi)生產(chǎn)新型疫苗。最近新抗原的發(fā)現(xiàn)和鑒定促進了個性化疫苗治療的發(fā)展,。BioNTech和Moderna進行的幾項臨床研究表明,，在一些治療多發(fā)性實體瘤的臨床試驗中，使用個性化疫苗具有強大的抗腫瘤免疫,，開創(chuàng)了治療性腫瘤疫苗的新時代,。我們有理由認為，mRNA療法將可能改變現(xiàn)代醫(yī)學(xué)的疫苗接種方法以及癌癥免疫療法,。
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