華南理工大學(xué)附屬廣州市第一人民醫(yī)院劉大漁研究員課題組在國際著名期刊Biosensors and Bioelectronics(2020年影響因子:10.618)在線發(fā)表研究成果( Active droplet-array microfluidics-based chemiluminescence immunoassay for point-of-care detection of procalcitonin ),,詳細報道了課題組開發(fā)的主動式液滴陣列微流控化學(xué)發(fā)光免疫分析系統(tǒng),該系統(tǒng)由一臺緊湊型微流控分析儀和帶有預(yù)加載試劑的微流控芯片組成,。微流控分析儀可以在一次運行中并行操作五個微流控芯片,,該分析儀整合了溫度控制、磁驅(qū)動,、機械運動和光學(xué)檢測模塊,,確保整個化學(xué)發(fā)光免疫分析的工作流程可以自動化完成。微流控芯片是由微縫連接的微腔(Microslit-connected microchambers)構(gòu)成,,所有試劑都預(yù)先裝入油包水滴中,。此款微流控化學(xué)發(fā)光免疫分析系統(tǒng)在檢測靈敏度、動態(tài)范圍,、儀器尺寸及周轉(zhuǎn)時間等方面具有顯著優(yōu)勢,,非常適合基層醫(yī)療機構(gòu)使用,確保其在短時間內(nèi)獲取疾病生物標(biāo)志物信息,。
微流控化學(xué)發(fā)光免疫分析系統(tǒng)
一,、微流控分析儀
微流控分析儀的尺寸為30cm×30cm×30cm,重量約為10kg,。該儀器可以在一次運行中安裝五個微流控芯片,,允許同時執(zhí)行五個測試。分析儀包含溫度控制,、磁驅(qū)動,、機械運動和光學(xué)檢測模塊。①溫度控制模塊:將微流控芯片所處環(huán)境溫度恒定保持在37℃,,確??乖贵w結(jié)合效率;②磁驅(qū)動和機械運動模塊:通過程序化移動磁柱(magnet column)來控制磁珠(magnetic beads)的狀態(tài),;③光學(xué)檢測模塊:使用光電倍增管(PMT)檢測酶致發(fā)光反應(yīng)產(chǎn)生的化學(xué)發(fā)光信號,。為避免外部光源對化學(xué)發(fā)光信號的干擾,整個反應(yīng)在全封閉環(huán)境中運行,。當(dāng)反應(yīng)完成后,,PMT依次獲取五個芯片的化學(xué)發(fā)光信號,,曝光時間為100ms,信號強度由儀器軟件直接讀出,。

圖1 (左圖)微流控分析儀照片,;(右圖)微流控分析儀結(jié)構(gòu)示意圖
二、微流控芯片
微流控芯片是由芯片主體(注塑工藝,,黑色聚碳酸酯)和頂蓋(3D打印工藝,,光敏樹脂)構(gòu)成。芯片本體(110mm×15mm×5mm)包含5個微腔,,每個微腔間有0.5mm寬的微縫,。微流控芯片頂蓋設(shè)計有三個孔,從前到后依次是樣品裝載孔,、排氣孔和注射孔,,頂蓋底部設(shè)計有四個插入微縫的塞子(圖2)。在頂蓋與芯片主體組裝之前,,頂蓋內(nèi)表面需涂覆一層納米保護溶液,。頂蓋位置移動可以改變微縫的開與關(guān),該芯片共支持三種位置變化(圖3),,這三個位置分別適用于裝油,、試劑儲存/轉(zhuǎn)運和化學(xué)發(fā)光免疫分析。

圖2 微流控芯片由芯片本體(黑色)和頂蓋(白色)組成

圖3 頂蓋的三個位置狀態(tài)(頂蓋位置移動可改變微縫的開與關(guān))
微流控化學(xué)發(fā)光免疫分析包括四個步驟(圖4,、圖5):
1、免疫磁珠捕獲目標(biāo)蛋白:將樣品和磁珠裝入微腔①中孵育3分鐘,,以使樣品中的抗原與磁珠上的捕獲抗體結(jié)合,。2、形成雙抗夾心結(jié)構(gòu):磁柱(magnet column)上升激活磁珠(magnetic beads),,磁力驅(qū)動磁珠經(jīng)過微縫進入微腔②,。將磁珠轉(zhuǎn)移到含有酶標(biāo)記抗體(檢測抗體)的液滴中孵育3分鐘,磁珠-捕獲抗體-抗原復(fù)合物與檢測抗體特異性結(jié)合,,形成雙抗體夾心復(fù)合物(磁珠-捕獲抗體-抗原-檢測抗體),。3、磁珠清洗:驅(qū)動磁珠依次進入微腔③和微腔④,,微腔③和微腔④含有洗滌緩沖液,,磁珠被洗滌兩次,每次洗滌20秒,。4,、酶化學(xué)發(fā)光反應(yīng):驅(qū)動磁珠進入含有化學(xué)發(fā)光底物溶液的微腔⑤。孵育40秒使其產(chǎn)生化學(xué)發(fā)光后,,PMT收集化學(xué)發(fā)光信號,。

圖4 微流控芯片中試劑的預(yù)存儲

圖5 微流控化學(xué)發(fā)光免疫分析的工作流程
磁柱上升,,磁珠激活;磁柱下降,,磁珠失活,。在每個步驟中,當(dāng)磁珠進入液滴時,,磁柱下降,,使磁珠失活。同時,,微流控芯片承載平臺來回移動,,通過液滴攪拌促進磁珠與試劑的相互作用(圖6)。

圖6 磁驅(qū)動液滴操控
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