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制備DLIN-MC3脂質納米顆粒

　　實驗目的：

　　分別以DLIN-MC3為陽離子主要脂質,，參照文獻方法制備包載mRNA的LNP。

　　實驗原理：

　　DLIN-MC3是可解離脂質,，在酸性條件下可質子化形成陽離子脂質,，通過靜電作用于帶負電的mRNA結合，形成載有mRNA的脂質納米顆粒(lipid nanoparticles,LNPs),。常見的制備方法有薄膜-水化法,、溶劑注入法、高壓均質法和微流控法等方法,，在本實驗中采用微流控法,，讓脂質溶液與和mRNA溶液在微混合器中充分、迅速的混合,，形成粒徑均一的LNP,。由于脂質溶解于乙醇中，核酸溶解于酸性緩沖液中,，因此需要透析去除殘余的乙醇并換液至PBS,。

　　實驗材料：

　　DLIN-MC3、DSPC,、DMG-PEG2000,、冰醋酸,、三水醋酸鈉

　　實驗步驟：

　　1、 配置脂質乙醇溶液：

　　　　a) LNP 的成分與分子量見下表：

　　百分比來源于前期研究,，并不一定與 onpattro 和 mRNA-1273 相同,。

　　　　b)每種成分別配置三個濃度：8 mM（約5 mg/ml）、12 mM（約7.5 mg/ml）和16 mM（約10 mg/ml）,。

　　2,、 計算 mRNA 濃度：

　　　　a) 根據 N/P=6，F(xiàn)RR=3 計算所需 RNA 濃度,。

　　　　b) RNA 的堿基的平均分子量為340,，每個堿基攜帶1 個磷酸，因此RNA 中的含磷量為3.1 nmol/μg.

　　　　c) 計算氮磷比時僅計算主要脂質中的氮原子數(shù),，因此每摩爾混合脂質中含有 0.5 摩爾 N,。

　　3、 配置 mRNA-醋酸緩沖液：

　　　　稱取3.2g三水醋酸鈉,，8ml冰醋酸，定容于1000ml,。加入相應梯度的mRNA

　　4、 微流控混合：

　　　　a. 將脂質-乙醇溶液過 0.22 μm 疏水聚四氟乙烯膜,，mRNA-檸檬酸緩沖液過 0.22 μm 親水聚四氟乙烯膜,，過膜后裝入微量注射器中。

　　　　b. 以FRR=3 ,，磷脂和緩沖液以0.2ml/min和0.6ml/min,，通過nexstarnano1芯片,，混合,。

　　5,、 透析與儲存：

　　　　a) 制備后放入透析管（Slide-A-Lyzer™ MINI Dialysis Device, 10K MWCO, 0.5 mL）中加入 14 ml PBS在搖床上透析，2 小時后換液,，直至 18 小時后透析結束。

　　　　b) 保存于 4℃待用,。

實驗名稱：LNP 包封率測定

　　實驗目的：

　　　　對制備的 LNP 包封 mRNA 的效果進行測定

　　實驗原理：

　　　　Quant-iT™RiboGreen®RNA 試劑是一種超靈敏的熒光核酸染色劑，可檢測溶液中 1-200 ng 的核酸,，這種核酸染料無法透過 LNP,，因此只有游離的未被 LNP 包載的核酸可以被結合。Triton-100 作為一種表面活性劑常被用做破乳劑,，使用 1%的 Triton-100 處理獲得的 LNP-mRNA 可以使包載的核酸釋放,，得到總核酸量,。通過計算破乳前后核酸量的差異得到載藥量，再除以總核酸量即可得到包封率,，即：

包封率（%）=（破乳后定量-破乳前定量）/破乳后定量

　　實驗材料：

　　　　Quant-iT ™ RiboGreen ™ RNA   檢 測 試 劑 盒 （ Thermo  Fisher ,， R11490 ）、 Triton ™ X-100

　　　?。⊿IGMA-ALDRICH,，T8787-100ML）、DEPC 水,、CellCarrier-96 Ultra Microplates  （ PerkinElmer，6055308）,、 LNP-mRNA

　　實驗步驟：

　　　　1. LNP 制備：

　　　　　　見 LNP 制備流程。

　　　　2. 試劑準備（詳細參見說明書）：

　　　　　　將 20xTE 用 DEPC 水稀釋至 1x；

　　　　　　用稀釋好的 1XTE 稀釋試劑盒中的標準品,，稀釋成 2 μg/mL 及 100 ng/mL 兩種終濃度,；

　　　　　　用 1xTE 稀釋試劑盒中的 QuantiT™ RiboGreen® Reagen,，稀釋成 200 倍及 2000 倍兩種終濃度,； 按照下表在 CellCarrier-96 Ultra Microplates 中加入以下試劑，做復孔：

High range

Low range

1. LNP 破乳

將 Triton-100 用 1xTE 稀釋到 2%,，取 100 μl 加入 CellCarrier-96 Ultra Microplates,，加入 1 μl 制備好的

LNP，處理 5 分鐘,，加入 100 μl 200-fold diluted quant-iT RiboGreen Reagent。

2. LNP 游離核酸測定

在 CellCarrier-96 Ultra Microplates 中加入 100ul1xTE,，取 1μl 制備好的 LNP 加進去,，混勻,，加入 100 μl l2000-fold diluted quant-iT RiboGreen Reagent。

3. 讀板

使用 SPARK 讀取熒光強度，激發(fā)光設置為 480 nm,，發(fā)射光為 520 nm

4. 數(shù)據處理

1） 標曲制備

High range	Low range

2) 樣品定量

載藥量=破乳后讀值-破乳前讀值包封率（%）=載藥量/破乳后讀值