【摘要】：影響ELISA中非特異性顯色的原因很多，如試劑盒特異性,、檢驗(yàn)標(biāo)本中含酶標(biāo)記物的干擾物,，操作過程中的問題。本文就這一原因作一簡要分析,以便可以通過以上措施把非特異顯色降至zui低限度,，從而提高檢測的特異性,，并得到更準(zhǔn)確、可靠的實(shí)驗(yàn)結(jié)果,。

【關(guān)鍵詞】 ELISA 非特異性 顯色

酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)（ELISA）自1971年自問世以來,，以其敏感性高，特異性強(qiáng),，操作簡便,、安全，而廣泛應(yīng)用于臨床診斷,，開創(chuàng)了免疫學(xué)診斷的新紀(jì)元,。但同其它免疫診斷方法一樣酶免試劑在它的研究、生產(chǎn)及使用中常常會碰到非特異性問題,，本文就在實(shí)驗(yàn)過程中產(chǎn)生的一些原因及如何采取一些措施,，消除非特異性顯色作一分析。

1,、試劑盒特異性因素

1 .固相載體的選擇,。ELISA中常用的固相載體有微量滴定板、小珠和小試管三種,，以微量滴定板最為常見[1],。它具有良好的吸附性能，孔底透明度高,，空白值低,，各板之間、同一板各孔之間性能相近,。聚苯乙烯ELISA板由于原料的不同和制作工藝的差別,，各產(chǎn)品的質(zhì)量差異很大。因此,，在選擇試劑盒同時(shí)要對其使用的微孔板型號進(jìn)行認(rèn)證,，評估。

2.包被物的純度,。在酶聯(lián)免疫測定尤其是間接ELISA中,，試劑的特異性取決于使用抗原的純度,。目前由于技術(shù)條件的限制，包被用抗原或抗體的純度不可能達(dá)到100%,，所以有些非特異性顯色不可避免,，只能盡可能提高純度，提高特異性,。目前使用的包被抗原一般為合成多肽抗原,。

3.包被抗體的效價(jià)。具有高親和力和高特異性的包被抗體,，是決定試劑特異性的重要方面,。

4. 封閉。是ELISA中重要的一步,，目的是封閉固相載體表面尚未被所占據(jù)的空隙[2],，減少后續(xù)步驟中非特異性蛋白的干擾。

5.檢驗(yàn)標(biāo)本中含有酶標(biāo)記物的干擾物

6.內(nèi)源性干擾物：類風(fēng)濕因子（RF）,、黃疸等,，類風(fēng)濕因子是可作用于多種動(dòng)物以及人IgGFc段的自身抗體，多數(shù)為IgM類,，能充當(dāng)抗原成分與固相及酶標(biāo)抗體反應(yīng),，從而呈現(xiàn)非特異性顯色。

黃疸血標(biāo)本中常含有內(nèi)源性過氧化物酶,，如用辣根過氧化物酶為標(biāo)記物,，就有可能產(chǎn)生非特異性顯色。

7. 外源性干擾物,，常常因樣品采集,、貯存、處理不當(dāng)造成如樣品溶血,，被細(xì)菌污染,，標(biāo)本凝集不全等。溶血標(biāo)本,，紅細(xì)胞溶解破裂,，釋放出血紅素形成，而血紅素中的鐵卟啉是過氧化物酶的類似物,，以HRP為標(biāo)記的ELISA測定中，溶血標(biāo)本可能會增加非特異性顯色,。如有細(xì)菌污染,，菌體中可能含有內(nèi)源性HRP（辣根過氧化酶）[2]，有國內(nèi)報(bào)道酶免HBsAg試劑檢測溶血標(biāo)本時(shí)可造成假陽性[3],。如在冰箱中保存過久,，其中的IgG可發(fā)生聚合,，在間接法ELISA中可使本底加深[2]。因此,，血標(biāo)本在采集處理時(shí)應(yīng)小心,，在冰箱中保存不易過久。

標(biāo)本凝集不全時(shí),，血清中會殘留部分纖維蛋白原,，也易造成假陽性。

8.操作過程中的問題造成假陽性

9.加樣

對于間接ELISA標(biāo)本一般都要進(jìn)行稀釋,，如果加樣不準(zhǔn)就會造成誤差,，尤其當(dāng)稀釋倍數(shù)大時(shí)，很小的絕對誤差,，會導(dǎo)致較大的相對誤差,，使陰性（或弱陽性）標(biāo)本呈陽性（或陰性）。加樣時(shí)應(yīng)將所加物加在ELISA板孔的底部,，避免加在孔壁上部,，并注意不可濺出，不可產(chǎn)生氣泡,。目前,，大部分血站都已使用全自動(dòng)酶免加樣系統(tǒng)處理標(biāo)本，可較好地避免以上誤差,。

10.洗滌

在ELISA中正確的洗滌是保證得到可重復(fù)結(jié)果的關(guān)健一步,，應(yīng)引起操作者重視。無論是手工操作還是機(jī)器操作,，得出不正確的結(jié)果常與不正確的洗滌有關(guān),，ELISA就是靠洗滌來達(dá)到分離游離和結(jié)合的酶標(biāo)記物的目的。通過洗滌以消除殘留在板孔中沒能與固體抗原或抗體結(jié)合的物質(zhì),，以及在反應(yīng)過程中非特異性吸附于固相載體的干擾物質(zhì),。

11. 溫育

每種試劑都有其最佳反應(yīng)模式，其中溫度和溫育時(shí)間控制是重要因素,。因孵育溫度高,，反應(yīng)時(shí)間長，會造成整板本底高,，陽性率高,。溫育一般用濕盒或水浴，反應(yīng)板不宜疊放,，以保證各板溫度都能迅速平衡,，為避免蒸發(fā)，板上應(yīng)加蓋,。

12.酶標(biāo)儀判讀

作為記錄測定結(jié)果的儀器,，酶標(biāo)儀的性能穩(wěn)定與否,，決定結(jié)果的可靠度。首先酶標(biāo)儀應(yīng)定期進(jìn)行保養(yǎng),，對濾光片要定期校正,；其次酶標(biāo)儀波長設(shè)置要正確，最好使用雙波長,，一個(gè)檢測波長,，一個(gè)參比波長，以消除微孔板底部劃痕,、不平,、指印或液面高度差異造成的光干擾。此外,，在用酶標(biāo)儀讀數(shù)時(shí)最好先擦試微孔板底部并壓平板條,。由于各種酶標(biāo)儀性能有所不同，使用中應(yīng)詳細(xì)閱讀說明書

綜上所述,，由于酶聯(lián)免疫吸附技術(shù)目前在技術(shù)上缺乏標(biāo)準(zhǔn)化,，盡管目前國際上以及我國有了部分標(biāo)準(zhǔn)血清或參比血清（血清盤）。但由于受方法學(xué)及技術(shù)條件的限制,，在酶聯(lián)吸附測定中有時(shí)不可避免的會出現(xiàn)一定的非特異性,，但我們可以通過以上措施把非特異性顯色降至zui低限底，從而提高檢測的特異性,，并得到更準(zhǔn)確,、可靠的實(shí)驗(yàn)結(jié)果。