【摘要】：影響ELISA中非特異性顯色的原因很多,，如試劑盒特異性,、檢驗(yàn)標(biāo)本中含酶標(biāo)記物的干擾物，操作過(guò)程中的問(wèn)題,。本文就這一原因作一簡(jiǎn)要分析,以便可以通過(guò)以上措施把非特異顯色降至zui低限度,，從而提高檢測(cè)的特異性，并得到更準(zhǔn)確,、可靠的實(shí)驗(yàn)結(jié)果,。

【關(guān)鍵詞】 ELISA 非特異性 顯色

酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)（ELISA）自1971年自問(wèn)世以來(lái),，以其敏感性高,，特異性強(qiáng),，操作簡(jiǎn)便、安全,，而廣泛應(yīng)用于臨床診斷,，開(kāi)創(chuàng)了免疫學(xué)診斷的新紀(jì)元。但同其它免疫診斷方法一樣酶免試劑在它的研究,、生產(chǎn)及使用中常常會(huì)碰到非特異性問(wèn)題,，本文就在實(shí)驗(yàn)過(guò)程中產(chǎn)生的一些原因及如何采取一些措施，消除非特異性顯色作一分析,。

1,、試劑盒特異性因素

1 .固相載體的選擇。ELISA中常用的固相載體有微量滴定板,、小珠和小試管三種,，以微量滴定板最為常見(jiàn)[1]。它具有良好的吸附性能,，孔底透明度高,，空白值低，各板之間,、同一板各孔之間性能相近,。聚苯乙烯ELISA板由于原料的不同和制作工藝的差別，各產(chǎn)品的質(zhì)量差異很大,。因此,，在選擇試劑盒同時(shí)要對(duì)其使用的微孔板型號(hào)進(jìn)行認(rèn)證，評(píng)估,。

2.包被物的純度,。在酶聯(lián)免疫測(cè)定尤其是間接ELISA中，試劑的特異性取決于使用抗原的純度,。目前由于技術(shù)條件的限制,，包被用抗原或抗體的純度不可能達(dá)到100%，所以有些非特異性顯色不可避免,，只能盡可能提高純度,，提高特異性。目前使用的包被抗原一般為合成多肽抗原,。

3.包被抗體的效價(jià),。具有高親和力和高特異性的包被抗體，是決定試劑特異性的重要方面,。

4. 封閉,。是ELISA中重要的一步，目的是封閉固相載體表面尚未被所占據(jù)的空隙[2]，減少后續(xù)步驟中非特異性蛋白的干擾,。

5.檢驗(yàn)標(biāo)本中含有酶標(biāo)記物的干擾物

6.內(nèi)源性干擾物：類風(fēng)濕因子（RF）,、黃疸等，類風(fēng)濕因子是可作用于多種動(dòng)物以及人IgGFc段的自身抗體,，多數(shù)為IgM類,，能充當(dāng)抗原成分與固相及酶標(biāo)抗體反應(yīng)，從而呈現(xiàn)非特異性顯色,。

黃疸血標(biāo)本中常含有內(nèi)源性過(guò)氧化物酶,，如用辣根過(guò)氧化物酶為標(biāo)記物，就有可能產(chǎn)生非特異性顯色,。

7. 外源性干擾物,，常常因樣品采集、貯存,、處理不當(dāng)造成如樣品溶血,，被細(xì)菌污染，標(biāo)本凝集不全等,。溶血標(biāo)本,，紅細(xì)胞溶解破裂，釋放出血紅素形成,，而血紅素中的鐵卟啉是過(guò)氧化物酶的類似物,，以HRP為標(biāo)記的ELISA測(cè)定中，溶血標(biāo)本可能會(huì)增加非特異性顯色,。如有細(xì)菌污染,，菌體中可能含有內(nèi)源性HRP（辣根過(guò)氧化酶）[2]，有國(guó)內(nèi)報(bào)道酶免HBsAg試劑檢測(cè)溶血標(biāo)本時(shí)可造成假陽(yáng)性[3],。如在冰箱中保存過(guò)久,，其中的IgG可發(fā)生聚合，在間接法ELISA中可使本底加深[2],。因此,，血標(biāo)本在采集處理時(shí)應(yīng)小心，在冰箱中保存不易過(guò)久,。

標(biāo)本凝集不全時(shí),，血清中會(huì)殘留部分纖維蛋白原，也易造成假陽(yáng)性,。

8.操作過(guò)程中的問(wèn)題造成假陽(yáng)性

9.加樣

對(duì)于間接ELISA標(biāo)本一般都要進(jìn)行稀釋,，如果加樣不準(zhǔn)就會(huì)造成誤差，尤其當(dāng)稀釋倍數(shù)大時(shí),，很小的絕對(duì)誤差,，會(huì)導(dǎo)致較大的相對(duì)誤差,，使陰性（或弱陽(yáng)性）標(biāo)本呈陽(yáng)性（或陰性）。加樣時(shí)應(yīng)將所加物加在ELISA板孔的底部,，避免加在孔壁上部,，并注意不可濺出，不可產(chǎn)生氣泡,。目前，大部分血站都已使用全自動(dòng)酶免加樣系統(tǒng)處理標(biāo)本,，可較好地避免以上誤差,。

10.洗滌

在ELISA中正確的洗滌是保證得到可重復(fù)結(jié)果的關(guān)健一步，應(yīng)引起操作者重視,。無(wú)論是手工操作還是機(jī)器操作,，得出不正確的結(jié)果常與不正確的洗滌有關(guān)，ELISA就是靠洗滌來(lái)達(dá)到分離游離和結(jié)合的酶標(biāo)記物的目的,。通過(guò)洗滌以消除殘留在板孔中沒(méi)能與固體抗原或抗體結(jié)合的物質(zhì),，以及在反應(yīng)過(guò)程中非特異性吸附于固相載體的干擾物質(zhì)。

11. 溫育

每種試劑都有其最佳反應(yīng)模式,，其中溫度和溫育時(shí)間控制是重要因素,。因孵育溫度高，反應(yīng)時(shí)間長(zhǎng),，會(huì)造成整板本底高,，陽(yáng)性率高。溫育一般用濕盒或水浴,，反應(yīng)板不宜疊放,，以保證各板溫度都能迅速平衡，為避免蒸發(fā),，板上應(yīng)加蓋,。

12.酶標(biāo)儀判讀

作為記錄測(cè)定結(jié)果的儀器，酶標(biāo)儀的性能穩(wěn)定與否,，決定結(jié)果的可靠度,。首先酶標(biāo)儀應(yīng)定期進(jìn)行保養(yǎng)，對(duì)濾光片要定期校正,；其次酶標(biāo)儀波長(zhǎng)設(shè)置要正確,，最好使用雙波長(zhǎng)，一個(gè)檢測(cè)波長(zhǎng),，一個(gè)參比波長(zhǎng),，以消除微孔板底部劃痕、不平,、指印或液面高度差異造成的光干擾,。此外,，在用酶標(biāo)儀讀數(shù)時(shí)最好先擦試微孔板底部并壓平板條。由于各種酶標(biāo)儀性能有所不同,，使用中應(yīng)詳細(xì)閱讀說(shuō)明書(shū)

綜上所述,，由于酶聯(lián)免疫吸附技術(shù)目前在技術(shù)上缺乏標(biāo)準(zhǔn)化，盡管目前國(guó)際上以及我國(guó)有了部分標(biāo)準(zhǔn)血清或參比血清（血清盤(pán)）,。但由于受方法學(xué)及技術(shù)條件的限制,，在酶聯(lián)吸附測(cè)定中有時(shí)不可避免的會(huì)出現(xiàn)一定的非特異性，但我們可以通過(guò)以上措施把非特異性顯色降至zui低限底,，從而提高檢測(cè)的特異性,，并得到更準(zhǔn)確、可靠的實(shí)驗(yàn)結(jié)果,。