(3)操作技術(shù)的影響

操作過程的控制：

1嚴(yán)格按照試劑說明書進行操作,。操作前將試劑在室溫下平衡30～60min,。

2加樣后及時放人孵箱,。標(biāo)本較多時，要分批操作,。按說明步驟嚴(yán)格控制操作時間,，防止孵育時間人為延長，導(dǎo)致非特異性結(jié)合緊附于反應(yīng)孔周圍,，難以清洗che底,。

3封板溫育時，各孔一定要封嚴(yán),，防止陽性標(biāo)本的液體蒸發(fā),，產(chǎn)生周邊現(xiàn)象從而導(dǎo)致“花板"的出現(xiàn)。

4用洗板機洗板時,，保證洗液注滿各孔,，洗板針暢通，洗完板后在吸水紙(選擇干凈,、無或少塵的吸水材料)上輕輕拍干：還要防止針口有纖維蛋白或異物,，這些異物在洗板的過程中易產(chǎn)生拖帶現(xiàn)象而導(dǎo)致“花板"的出現(xiàn)。

5合理安排檢測量,，以免反應(yīng)板過多造成洗板等待時間長,。

6加酶試劑后用吸水紙在酶標(biāo)板表面輕拭吸干。

7顯色劑盡量在臨用前配制,，堅持不用過期顯色劑,，肉眼可見淺藍色的TMB顯色劑不用。

8加樣時保持顯色劑不外流;A,、B液應(yīng)避免接觸金屬器械,。加終止液時應(yīng)避免產(chǎn)生氣泡。

9應(yīng)保證C清潔,，整個操作過程中保證酶標(biāo)板不接觸次氯酸,。以上的措施可以使“花板"降至zui低限度。從而提高檢測的特異性,。并得到更準(zhǔn)確,、可靠的實驗結(jié)果。

加樣吸嘴的潔凈與否和吸量的準(zhǔn)確性,，直接影響檢測結(jié)果,。由于吸嘴構(gòu)造特殊，導(dǎo)致清洗困難，加大了交叉污染的機會,。建議用一次性吸嘴,。加樣器也要經(jīng)常清洗，定期校準(zhǔn),。加樣時應(yīng)將所加物加在 ELISA 板孔的底部,，避免加在孔壁上部，并注意不可濺出,。

溫浴影響,，在建立 ELISA 方法作反應(yīng)動力學(xué)研究時，實驗表明,，兩次抗原 抗體 反應(yīng)一般在37℃經(jīng)1-2 小時,，產(chǎn)物的生成可達ding峰。為避免蒸發(fā),，板上應(yīng)加蓋,，也可用塑料貼封紙或保鮮膜覆蓋板孔，反應(yīng)板不宜疊放,，以保證各板的溫度都能迅速平衡,。應(yīng)注意溫育的溫度和時間應(yīng)按規(guī)定力求準(zhǔn)確。由于公司的 試劑 盒溫育是在空氣浴中完成,，采用水浴會造成值偏高或花板,。另外溫育中還有邊緣效應(yīng)，邊上的值會偏高,，建議為了客觀的判斷結(jié)果,，將質(zhì)控放在非邊緣位置。96孔酶標(biāo)板結(jié)構(gòu)特別;易產(chǎn)生邊緣效應(yīng),，抗原抗體結(jié)合及酶促反應(yīng)對溫度有嚴(yán)格要求,，酶標(biāo)板周圍與內(nèi)部孔升降溫速率不同，造成周邊與內(nèi)部孔結(jié)果差異;干浴與水浴存在明顯的差異,，盡可能使用水浴,，并要求固相板放入水中，減少受熱不均,，貼密封膜,，防止污物浸入。

洗滌在 ELISA 過程中雖不是一個反應(yīng)步驟,，但卻決定著實驗的成敗,。ELSIA 就是靠洗滌來達到分離游離的和結(jié)合的酶標(biāo)記物的目的。通過洗滌以清除殘留在板孔中沒能與固相抗原或抗體結(jié)合的物質(zhì),，以及在反應(yīng)過程中非特異性地吸附于固相載體的干擾物質(zhì)。聚苯乙烯等塑料對蛋白質(zhì)的吸附是普遍性的，而在洗滌時應(yīng)把這種非特異性吸附的干擾物質(zhì)洗滌下來,?？梢哉f在ELISA 操作中，洗滌是zui主要的關(guān)鍵技術(shù),，應(yīng)引起操作者的高度重視,，操作者應(yīng)嚴(yán)格按要求洗滌，不得馬虎,。

洗滌液多為含非離子型洗滌劑的中性緩沖液,，各種 試劑 盒的洗液不要混用。聚苯乙烯載體與蛋白質(zhì)的結(jié)合是疏水性的,，非離子型洗滌劑既含疏水基團,，也含親水基團，其疏水基團與蛋白質(zhì)的疏水基團借疏水鍵結(jié)合,，從而削弱蛋白質(zhì)與固相載體的結(jié)合,，并借助于親水基團和水分子的結(jié)合作用，使蛋白質(zhì)回復(fù)到水溶液狀態(tài),，從而脫離固相載體,。洗滌液中的非離子型洗滌劑一般是吐溫20，其濃度可在0.05%-0.2%之間,，高于0.2%時,，可使包被在固相上的抗原或抗體解吸附而減低試驗的靈敏度。洗液需要稀釋,，應(yīng)按要求稀釋,。配制洗液應(yīng)用新鮮的和高質(zhì)量的純化水，電導(dǎo)率小于1.5μs/cm,，洗液如果結(jié)晶應(yīng)待其融解后配制,。手洗條件一致性較差，對結(jié)果影響較大,，防止洗液在孔內(nèi)形成氣泡,。半自動與全自動冼板機使用不當(dāng)也會影響結(jié)果，血清中殘留的的纖維蛋白絲或洗滌液析出的結(jié)晶易使洗板機針小孔全阻塞或半阻塞狀態(tài),，造成未結(jié)合標(biāo)記酶洗脫不che底,，導(dǎo)致“花板"造成假陽性或假陰性;所以操作洗板機過程中要不時觀察洗板機針孔內(nèi)洗液的通暢狀況，及時糾正,，洗板機不用時應(yīng)用去離子水清冼幾遍,。