檢測(cè)原理

試劑盒采用雙抗一步夾心法酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)（ELISA）,。往預(yù)先包被發(fā)熱伴血小板減少綜合征病毒抗原的包被微孔中,，依次加入標(biāo)本,、HRP標(biāo)記的檢測(cè)抗體，經(jīng)過(guò)溫育并*洗滌,。用底物TMB顯色,，TMB在過(guò)氧化物酶的催化下轉(zhuǎn)化成藍(lán)色，并在酸的作用下轉(zhuǎn)化成最終的黃色,。用酶標(biāo)儀在450nm波長(zhǎng)下測(cè)定吸光度（OD 值）,，與CUTOFF值相比較，從而判定標(biāo)本中發(fā)熱伴血小板減少綜合征病毒抗體（SFTSV-Ab）的存在與否,。

樣品收集,、處理及保存方法

1.  血清：使用不含熱原和內(nèi)毒素的試管，操作過(guò)程中避免任何細(xì)胞刺激,，收集血液后,，3000轉(zhuǎn)離心10分鐘將血清和紅細(xì)胞迅速小心地分離。

2.  血漿：EDTA,、檸檬酸鹽或肝素抗凝,。3000轉(zhuǎn)離心30分鐘取上清。

3.  細(xì)胞上清液：3000轉(zhuǎn)離心10分鐘去除顆粒和聚合物。

4.  組織勻漿：將組織加入適量生理鹽水搗碎,。3000轉(zhuǎn)離心10分鐘取上清,。

5.  保存：如果樣本收集后不及時(shí)檢測(cè)，請(qǐng)按一次用量分裝,，凍存于-20℃,，避免反復(fù)凍融，在室溫下解凍并確保樣品均勻地充分解凍,。

自備物品

1. 酶標(biāo)儀（450nm）

2. 高精度加樣器及槍頭：0.5-10uL,、2-20uL、20-200uL,、200-1000uL

3. 37℃恒溫箱

   操作注意事項(xiàng)

4.   試劑盒保存在2-8℃,，使用前室溫平衡20分鐘。從冰箱取出的濃縮洗滌液會(huì)有結(jié)晶,，這屬于正?，F(xiàn)象，水浴加熱使結(jié)晶*溶解后再使用,。

5.   實(shí)驗(yàn)中不用的板條應(yīng)立即放回自封袋中,，密封（低溫干燥）保存。

6.   預(yù)處理后的樣本無(wú)需稀釋,，直接取50μL加樣即可,。

7.   嚴(yán)格按照說(shuō)明書中標(biāo)明的時(shí)間、加液量及順序進(jìn)行溫育操作,。

8.   所有液體組分使用前充分搖勻,。

試劑的準(zhǔn)備

 20×洗滌緩沖液的稀釋：蒸餾水按1：20稀釋，即1份的20×洗滌緩沖液加19份的蒸餾水,。

洗板方法

1.   手工洗板：甩盡孔內(nèi)液體,，每孔加滿洗滌液，靜置1min后甩盡孔內(nèi)液體,，在吸水紙上拍干,，如此洗板5次。

2.   自動(dòng)洗板機(jī)：每孔注入洗液350μL,，浸泡1min,，洗板5次。

3. 操作步驟

4.   從室溫平衡20min后的鋁箔袋中取出所需板條,，剩余板條用自封袋密封放回4℃,。

5.   設(shè)置陰、陽(yáng)性對(duì)照孔和樣本孔,，陰,、陽(yáng)性對(duì)照孔中加入陰性對(duì)照,、陽(yáng)性對(duì)照各50μL；

6.   待測(cè)樣本孔加待測(cè)樣本50μL,；

     隨后陰,、陽(yáng)性對(duì)照孔和樣本孔中每孔加入辣根過(guò)氧化物酶（HRP）

1. 標(biāo)記的檢測(cè)抗體100μL，用封板膜封住反應(yīng)孔,，37℃水浴鍋或恒溫箱溫育60min,。

2.   棄去液體，吸水紙上拍干,，每孔加滿洗滌液,，靜置1min,，甩去洗滌液,，吸水紙上拍干，如此重復(fù)洗板5次（也可用洗板機(jī)洗板）,。

3.   每孔加入底物A,、B各50μL，37℃避光孵育15min,。

4.   每孔加入終止液50μL,，15min內(nèi)，在450nm波長(zhǎng)處測(cè)定各孔的OD值,。

   結(jié)果判斷

    1.  試驗(yàn)有效性：陽(yáng)性對(duì)照孔OD值平均值≥1.00,；

                   陰性對(duì)照孔OD值平均值≤0.15。

   2.  臨界值（Cut off）計(jì)算：臨界值=陰性對(duì)照孔平均值+0.15

   3.  陰性判斷：樣品OD值＜臨界值（Cut off）,，樣品為陰性

   4.  陽(yáng)性判斷：樣品OD值＞臨界值（Cut off）,，樣品為陽(yáng)性