大鼠磷酸化細胞外信號調(diào)節(jié)激酶（pERK)elisa試劑盒試驗原理：

本試劑盒應用雙抗體夾心法測定標本中調(diào)亡蛋白酶因子1(Apaf-1)水平,。用純化的調(diào)亡蛋白酶因子1(Apaf-1)抗體包被微孔板,，制成固相抗體，往包被單抗的微孔中依次加入調(diào)亡蛋白酶因子1(Apaf-1),再與HRP標記的調(diào)亡蛋白酶因子1(Apaf-1)抗體結(jié)合,，形成抗體抗原酶標抗體復合物,，經(jīng)過洗滌后加底物TMB顯色。TMB在HRP酶的催化下轉(zhuǎn)化成藍色,，并在酸的作用下轉(zhuǎn)化成終的黃色,。顏色的深淺和樣品中的調(diào)亡蛋白酶因子1(Apaf-1)呈正相關(guān)。用酶標儀在450nm波長下測定吸光度(OD值),，通過標準曲線計算樣品中調(diào)亡蛋白酶因子1(Apaf-1)濃度,。

大鼠磷酸化細胞外信號調(diào)節(jié)激酶（pERK)elisa試劑盒
自備材料

1． 蒸餾水。

2． 加樣器：5ul,、10ul,、50ul、100ul,、200ul,、500ul、1000ul,。

3． 振蕩器及磁力攪拌器等,。

操作注意事項:

1． 試劑應按標簽說明書儲存，使用前恢復到室溫,。稀釋過后的標準品應丟棄,，不可保存。

2． 實驗中不用的板條應立即放回包裝袋中,，密封保存,，以免變質(zhì)。

3． 不用的其它試劑,，應包裝好或蓋好,，不同批號的試劑不要混用，保質(zhì)前使用,。

4． 使用一次性的吸頭以免交叉污染,，吸取終止液和底物A,、B液時，避免使用帶金屬部分的加樣器,。

5． 使用干凈的塑料容器配置洗滌液,，使用前充分混勻試劑盒里的各種成份及樣品。

6． 洗滌酶標板時應充分拍干,，不要將吸水紙直接放入酶標反應孔中吸水,。

7． 底物A易揮發(fā)，避免長時間打開蓋子,，底物B對光敏感，避免長時間暴露于光下,。避免用手接觸,，有毒，實驗完成后應立即讀取OD值,。

8． 加入試劑的順序應一致,，以保證所有反應板孔溫育的時間一樣。

9． 按照說明書中標明的時間,、加液的量及順序進行溫育操作,。

操作步驟:

1． 使用前，將所有試劑充分混勻,。不要使液體產(chǎn)生大量的泡沫,，以免加樣時加入大量的氣泡，產(chǎn)生加樣上的誤差,。

2． 根據(jù)待測樣品數(shù)量加上標準品的數(shù)量決定所需的板條數(shù),，每個標準品和空白孔建議做復孔，每個樣品根據(jù)自己的數(shù)量來定,，能使用復孔的盡量做復孔,。標本用標本稀釋液1：1稀釋后加入50ul于反應孔內(nèi)。

3． 加入稀釋好后的標準品50ul于反應孔,、加入待測樣品50ul于反應孔內(nèi),。立即加入50ul的生物素標記的抗體，蓋上膜板,，輕輕振蕩混勻,，37℃溫育1小時。

4． 甩去孔內(nèi)液體,，每孔加滿洗滌液,，振蕩30秒，甩去洗滌液,，用吸水紙拍干,。重復此操作3次,，如果用洗板機洗滌，洗滌次數(shù)增加一次,。

5． 每孔加入50ul的親和鏈酶素-HRP,，輕輕振蕩混勻，37℃溫育30分鐘,。

6． 甩去孔內(nèi)液體,，每孔加滿洗滌液，振蕩30秒,，甩去洗滌液,，用吸水紙拍干。重復此操作3次,，如果用洗板機洗滌,，洗滌次數(shù)增加一次。

7． 每孔加入底物A,、B各50ul,，輕輕振蕩混勻，37℃溫育10分鐘,。避免光照,。

8． 取出酶標板，迅速加入50ul終止液,，加入終止液后應立即測定結(jié)果,。

9． 在450nm波長處測定各孔的OD值。

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