大鼠雷帕霉素靶蛋白（mTOR)elisa試劑盒試驗(yàn)原理：

本試劑盒應(yīng)用雙抗體夾心法測定標(biāo)本中調(diào)亡蛋白酶因子1(Apaf-1)水平,。用純化的調(diào)亡蛋白酶因子1(Apaf-1)抗體包被微孔板，制成固相抗體,，往包被單抗的微孔中依次加入調(diào)亡蛋白酶因子1(Apaf-1),再與HRP標(biāo)記的調(diào)亡蛋白酶因子1(Apaf-1)抗體結(jié)合,，形成抗體抗原酶標(biāo)抗體復(fù)合物，經(jīng)過洗滌后加底物TMB顯色,。TMB在HRP酶的催化下轉(zhuǎn)化成藍(lán)色,，并在酸的作用下轉(zhuǎn)化成終的黃色。顏色的深淺和樣品中的調(diào)亡蛋白酶因子1(Apaf-1)呈正相關(guān),。用酶標(biāo)儀在450nm波長下測定吸光度(OD值),，通過標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算樣品中調(diào)亡蛋白酶因子1(Apaf-1)濃度。

大鼠雷帕霉素靶蛋白（mTOR)elisa試劑盒
自備材料

1． 蒸餾水,。

2． 加樣器：5ul、10ul,、50ul,、100ul、200ul,、500ul,、1000ul。

3． 振蕩器及磁力攪拌器等,。

操作注意事項(xiàng):

1． 試劑應(yīng)按標(biāo)簽說明書儲存,，使用前恢復(fù)到室溫。稀釋過后的標(biāo)準(zhǔn)品應(yīng)丟棄,，不可保存,。

2． 實(shí)驗(yàn)中不用的板條應(yīng)立即放回包裝袋中，密封保存,，以免變質(zhì),。

3． 不用的其它試劑，應(yīng)包裝好或蓋好,，不同批號的試劑不要混用,，保質(zhì)前使用,。

4． 使用一次性的吸頭以免交叉污染，吸取終止液和底物A,、B液時,，避免使用帶金屬部分的加樣器。

5． 使用干凈的塑料容器配置洗滌液,，使用前充分混勻試劑盒里的各種成份及樣品,。

6． 洗滌酶標(biāo)板時應(yīng)充分拍干，不要將吸水紙直接放入酶標(biāo)反應(yīng)孔中吸水,。

7． 底物A易揮發(fā),，避免長時間打開蓋子，底物B對光敏感,，避免長時間暴露于光下,。避免用手接觸，有毒,，實(shí)驗(yàn)完成后應(yīng)立即讀取OD值,。

8． 加入試劑的順序應(yīng)一致，以保證所有反應(yīng)板孔溫育的時間一樣,。

9． 按照說明書中標(biāo)明的時間,、加液的量及順序進(jìn)行溫育操作。

操作步驟:

1． 使用前,，將所有試劑充分混勻,。不要使液體產(chǎn)生大量的泡沫，以免加樣時加入大量的氣泡,，產(chǎn)生加樣上的誤差,。

2． 根據(jù)待測樣品數(shù)量加上標(biāo)準(zhǔn)品的數(shù)量決定所需的板條數(shù)，每個標(biāo)準(zhǔn)品和空白孔建議做復(fù)孔,，每個樣品根據(jù)自己的數(shù)量來定,，能使用復(fù)孔的盡量做復(fù)孔。標(biāo)本用標(biāo)本稀釋液1：1稀釋后加入50ul于反應(yīng)孔內(nèi),。

3． 加入稀釋好后的標(biāo)準(zhǔn)品50ul于反應(yīng)孔,、加入待測樣品50ul于反應(yīng)孔內(nèi)。立即加入50ul的生物素標(biāo)記的抗體,，蓋上膜板,，輕輕振蕩混勻，37℃溫育1小時,。

4． 甩去孔內(nèi)液體,，每孔加滿洗滌液，振蕩30秒,，甩去洗滌液,，用吸水紙拍干,。重復(fù)此操作3次，如果用洗板機(jī)洗滌,，洗滌次數(shù)增加一次,。

5． 每孔加入50ul的親和鏈酶素-HRP，輕輕振蕩混勻,，37℃溫育30分鐘,。

6． 甩去孔內(nèi)液體，每孔加滿洗滌液,，振蕩30秒,，甩去洗滌液，用吸水紙拍干,。重復(fù)此操作3次,，如果用洗板機(jī)洗滌，洗滌次數(shù)增加一次,。

7． 每孔加入底物A,、B各50ul，輕輕振蕩混勻,，37℃溫育10分鐘,。避免光照。

8． 取出酶標(biāo)板,，迅速加入50ul終止液,，加入終止液后應(yīng)立即測定結(jié)果。

9． 在450nm波長處測定各孔的OD值,。

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