1  標(biāo)本的采取和保存
可用作elisa測定的標(biāo)本十分廣泛,，體液(如血清),、分泌物(唾液)和排泄物(如尿液、糞便)等均可作標(biāo)本以測定其中某種抗體或抗原成份,。有些標(biāo)本可直接進(jìn)行測定(如血清,、尿液)，有些則需經(jīng)預(yù)處理(如糞便和某些分泌物),。大部分ELISA檢測均以血清為標(biāo)本,。血漿中除尚含有纖維蛋白原和抗凝劑外，其他成份均同等于血清,。制備血漿標(biāo)本需借助于抗凝劑,，而血清標(biāo)本只要待血清自然凝固、xue塊收縮后即可取得,。除特殊情況外,，在醫(yī)學(xué)檢驗(yàn)中均以血清作為檢測標(biāo)本。

在ELISA中血漿和血清可同等應(yīng)用,。血清標(biāo)本可按常規(guī)方法采集,，應(yīng)注意避免溶血，紅細(xì)胞溶解時(shí)會釋放出具有過氧化物酶活性的物質(zhì),，以HRP為標(biāo)記的ELISA測定中,，溶血標(biāo)本可能會增加非特異性顯色。 血清標(biāo)本宜在新鮮時(shí)檢測,。如有細(xì)菌污染,，菌體中可能含有內(nèi)源性HRP，也會產(chǎn)生假陽性反應(yīng),。如在冰箱中保存過久,，其中的可發(fā)生聚合，在間接法ELISA中可使本底加深,。一般說來,，在5天內(nèi)測定的血清標(biāo)本可放置于4℃，超過一周測定的需低溫冰存,。凍結(jié)血清融解后,，蛋白質(zhì)局部濃縮,，分布不均，應(yīng)充分混勻宜輕緩,，避免氣泡，可上下顛倒混和,，不要在混勻器上強(qiáng)烈振蕩,。混濁或有沉淀的血清標(biāo)本應(yīng)先離心或過濾,，澄清后再檢測,。反復(fù)凍融會使抗體效價(jià)跌落，所以測抗體的血清標(biāo)本如需保存作多次檢測,，宜少量分裝冰存,。保存血清自采集時(shí)就應(yīng)注意無菌操作，也可加入適當(dāng)防腐劑,。

2  試劑的準(zhǔn)備
按試劑盒說明書的要求準(zhǔn)備實(shí)驗(yàn)中需用的試劑,。ELISA中用的蒸餾水或去離子水，包括用于洗滌的,，應(yīng)為新鮮的和高質(zhì)量的,。自配的緩沖液應(yīng)用pH計(jì)測量較正。從冰箱中取出的試驗(yàn)用試劑應(yīng)待溫度與室溫平衡后使用,。試劑盒中本次試驗(yàn)不需用的部分應(yīng)及時(shí)放回冰箱保存,。

3  加樣
在ELISA中一般有3次加樣步聚，即加標(biāo)本,，加酶結(jié)合物,，加底物。加樣時(shí)應(yīng)將所加物加在LEISA板孔的底部,，避免加在孔壁上部,，并注意不可濺出，不可產(chǎn)生氣泡,。 加標(biāo)本一般用微量加樣器,，按規(guī)定的量加入板孔中。每次加標(biāo)本應(yīng)更換吸嘴,，以免發(fā)生交叉污染,，也可用一次性的定量塑料管加樣。有此測定(如間接法ELISA)需用稀釋的血清,，可在試管中按規(guī)定的稀釋度稀釋后再加樣,。也可在板孔中加入稀釋液，再在其中加入血清標(biāo)本,，然后在微型震蕩器上震蕩1分鐘以保證混和,。加酶結(jié)合物應(yīng)用液和底物應(yīng)用液時(shí)可用定量多道加液器,，使加液過程迅速完成。

4  保溫
在ELISA中一般有兩次抗原抗體反應(yīng),，即加標(biāo)本和加酶結(jié)合物后,。抗原抗體反應(yīng)的完成需要有一定的溫度和時(shí)間,，這一保溫過程稱為溫育(incubation),，有人稱之為孵育，在ELISA中似不恰當(dāng),。 ELISA屬固相免疫測定,，抗原、抗體的結(jié)合只在固相表面上發(fā)生,。以抗體包被的夾心法為例,，加入板孔中的標(biāo)本，其中的抗原并不是都有均等的和固相抗結(jié)合的機(jī)會,，只有最貼近孔壁的一層溶液中的抗原直接與抗體接觸,。這是一個(gè)逐步平衡的過程，因此需經(jīng)擴(kuò)散才能達(dá)到反應(yīng)的終點(diǎn),。在其后加入的酶標(biāo)記抗體與固相抗原的結(jié)合也同樣如此,。這就是為什么ELISA反應(yīng)總是需要一定時(shí)間的溫育。

溫育常采用的溫度有43℃,、37℃,、室溫和4℃(冰箱溫度)等。37℃是實(shí)驗(yàn)室中常用的保溫溫度,，也是大多數(shù)抗原抗體結(jié)合的合適溫度,。在建立ELISA方法作反應(yīng)動(dòng)力學(xué)研究時(shí)，實(shí)驗(yàn)表明,，兩次抗原抗體反應(yīng)一般在37℃經(jīng)1-2小時(shí),，產(chǎn)物的生成可達(dá)頂。為加速反應(yīng),，可提高反應(yīng)的溫度,，有些試驗(yàn)在43℃進(jìn)行，但不宜采用更高的溫度,?？乖贵w反應(yīng)4℃，在放射免疫測定中多使反應(yīng)在冰箱中過夜,，以形成最多的沉淀,。但因所需時(shí)間太長，在ELISA中一般不予采用,。