1.提蛋白

（不同細胞類型的蛋白或細胞不同部位的蛋白提取方法或有不同,，需要提前查找資料）

我用的是凱基生物公司的全蛋白提取試劑盒 一般是取100 mg 標本 + 1 ml lysis buffer + 10 ul 磷酸酶抑制劑 + 10ul PMSF + 1 ul 蛋白酶抑制劑 放入研磨器研磨,，直至研磨成勻漿（注意冰上操作,，有的試劑盒說明在研磨時加液氮），倒入EP管,，放入離心機離心，12,000 g / 5 min,，取上清。

另一種提蛋白試劑,，用RIPA buffer (Gibco) + 1% cOmplete™, EDTA-free Protease Inhibitor (Sigma)

20mg樣品（盡量吸盡PBS） + 150 ul RIPA 溶液

冰上放置5~30min（趕時間可短）

蛋白定量-BCA測定方法（酶標板操作）

（如果不同樣品總蛋白表達量以及蛋白組分差異大，總蛋白調(diào)齊之后還需要看內(nèi)參蛋白的表達是否一致,，最后可根據(jù)內(nèi)參蛋白調(diào)整上樣量）

BSA標準品一般需用PBS稀釋液稀釋（按照protocol來）,。釋待測樣品至合適濃度，使樣品稀釋液（稀釋后濃度一般不超過測得標準品的最高濃度）,，總體積為20 μL,。據(jù)樣品數(shù)量,，按50體積BCA試劑A加1體積BCA試劑B ( 50:1 ) 配制適量BCA工作液，充分混勻,，每孔加入200 μL BCA工作液,。

37℃放置30分鐘（可調(diào)整時間）后,，以標準曲線0號管做參比,，在562 nm波長下比色，記錄吸光值,。以蛋白濃度 ( μg/ul )為橫坐標,，吸光值為縱坐標，繪出標準曲線,。

繪制標準曲線 y = 0.554x+0.0034

據(jù)所測樣品的吸光值（此處為y值）Average of triplicate,， 代入y = 0.554x+0.0034 得到蛋白濃度x值，乘以稀釋倍數(shù),。根據(jù)蛋白上樣量確定體積（如上樣總體積16ul (加 混勻的4x Laemmli+β-巰基乙醇 煮沸變性),，上樣量20ug，測得蛋白濃度5ug/ul,，則取蛋白提取液體積 volume = 20/5 = 4ul）,，補PBS 8ul，再加4x Laemmli 4ul, 使上樣體積相等,。一般99℃水浴變性5min（變性可嘗試不同時間,，如3min、7min或更長）,，保存于-80℃,。

（4x Laemmli 也可換成 5x loading buffer）加入5x loading buffer (即80ul 樣本 加 20ul loading buffer )，搖勻,，可用封口膜封口 (防止煮沸時EP管口因壓力高而彈開) 煮沸變性（溫度時間根據(jù)蛋白可做相應(yīng)調(diào)整）,。

2. wb

2.1 配膠

蛋白分子量大小不同，所使用的分離膠濃度也不同,，常用濃度有6%,、8%、10%,、12%,，分子量越大，所用的膠濃度越低,，蛋白電泳速度越快,。濃縮膠濃度均為 5%。分離膠的選擇：蛋白分子量很小時,，推薦使用10-12%,，例如蛋白分子量為 21kd 和 34kd ,，選取的膠濃度為10%；分子量80kd,，選10%,；分子量180kd，選6%,。

[電泳液也可用BIO-RAD 10x Tris/Glycine/SDS buffer, 直接取100ml buffer + 900ml 純水稀釋即可,。配膠可用TGX Stain-Free FastCast Acrylamide Kit, 10%或其它濃度]

加樣之前先簡單介紹一下。一般wb,、免疫熒光、免疫組化等組織病理學(xué)實驗樣本要求是每組不低于3個,，需要相互比較的組別加樣時放于同一塊膠上,。測目標蛋白之前先跑內(nèi)參蛋白，檢測各樣本的蛋白提取量是否相近,。內(nèi)參蛋白量一致,，再測目標蛋白。一般我用GAPDH作為內(nèi)參蛋白（不同組織有區(qū)別）,，分子量~35kd,。marker作為指示劑可以顯示目標蛋白所處的條帶位置及大概分子量，一般加3～5ul,。至于目標蛋白,，不同蛋白表達量不同，一般10～20ug,，可根據(jù)第一次的結(jié)果進行調(diào)整,。

2.2 電泳

電泳時長一般1.5h，先用80v 跑~30min,，使各樣本處于同一水平,，待marker開始分離后將電壓調(diào)至120v 再跑~1h。待loading buffer提示快跑出分離膠時,，準備配制轉(zhuǎn)膜液,。配方如圖。

2.3 轉(zhuǎn)膜（濕跑法）

轉(zhuǎn)膜是整個wb過程中最重要的一步,。Glycine14.1 g + Tris 3 g +800 ml 純水配好后,，放入冰袋預(yù)冷，之后加甲醇 800ml,。PVDF膜一般為2 x 8 cm 大小,。PVDF膜和膠要時刻保持濕潤，不能干,。將PVDF膜放入裝有甲醇的培養(yǎng)皿中活化~15秒,，再倒入轉(zhuǎn)膜液,。轉(zhuǎn)膜時要注意趕走膜與膠之間的氣泡。轉(zhuǎn)膜板如下圖,，在兩層濾膜之間依次放入膠和PVDF膜（膠對應(yīng)轉(zhuǎn)膜板黑色面/儀器黑色面-連接電源負極,，PCDF膜對應(yīng)轉(zhuǎn)膜板透明面/白色面/儀器紅色面-連接電源正極）。注意轉(zhuǎn)膜儀器正負極與電源相對應(yīng),。

轉(zhuǎn)膜時長和蛋白分子量有關(guān),，一般100 kb以內(nèi)的蛋白，轉(zhuǎn)膜時長1kb / 1min,，大于100kb,，改為1kb / 1.5分鐘。一般是恒流 200mA,，加冰袋,；分子量大時，可用300mA,，隔1h 換1次冰袋,，因為轉(zhuǎn)膜過程會產(chǎn)生大量熱量，避免儀器燒壞,。

（半干轉(zhuǎn)膜法）

可用BIO-RAD Trans-Blot Turbo 5x Transfer Buffer (1份 20ml) + ethanol (1份 20ml) + nanopure water (3份 60ml) (需預(yù)冷)

2A~2.5A,，恒壓25V，10min（可根據(jù)需要改變條件）BIO-RAD儀器,。

2.4 封閉和敷一抗

將PVDF膜放入封閉液（1% milk in 1x TBST + 0.1% Tween 20 ）中,，室溫下封閉~1h，也可根據(jù)需要延長至1.5h,。封口膜大小一般3.5 x 10.5cm（可用封閉盒,，盡量用純水或TBST清洗）。置于搖床上慢速搖~1h后,，置于4℃冰箱過夜,。

（驗證抗體很重要）

2.5 敷二抗和顯影

取出PVDF膜（條帶），用TBST洗滌3次,，5min /次,。若抗體效價不是很好，可適當(dāng)延長每次的洗滌時間,。再用相同的封閉液稀釋二抗,，置于搖床上搖1h。之后取出條帶再用TBST洗滌3次,，5min /次,。配顯影液，我用的是MILLIPORE品牌的,，比例1:1,，注意避光(可用錫箔紙),。每條帶滴約200ml 顯影液。

顯影成像時因不同曝光時間會影響成像效果,，一般取欠曝光,，適度曝光以及過度曝光多個曝光時間，取差異最大的圖像,。

tips: 剛從新鮮組織提前的蛋白記得搖勻分裝,，應(yīng)盡量在早期多做點wb條帶圖，便于后期數(shù)據(jù)補充分析,，提取的蛋白存放時間久以及反復(fù)凍融,，會導(dǎo)致蛋白降解，影響結(jié)果的準確性,。

wb房間沒有空調(diào),，夏天溫度太高導(dǎo)致膠很快就凝了，可以將玻璃板放在冰上預(yù)冷,，冬天用純水可以壓平分離膠，夏天可以用異丙醇壓平,。

TEMED具有神經(jīng)毒性和揮發(fā)性,，應(yīng)在通風(fēng)口處使用，避免搖晃,，避光低溫存儲,。

因答主測量的蛋白分子量比較靠近，之前一塊膠只轉(zhuǎn)了一個蛋白,，最近在想直接對整塊膠進行轉(zhuǎn)膜,，對不同蛋白進行半定量分析，這樣既能減少上樣誤差,，還可以直觀的看出不同蛋白間的變化趨勢,。所以試了下對整塊膠進行轉(zhuǎn)膜，加入兩種抗體,，此處一抗種屬來源不同,，因此二抗也不一樣，最后條帶結(jié)果并不理想,。目前還在摸索是否為抗體濃度的因素,。

另外，如果是發(fā)好的paper,，建議將膜保留下來,，注意保濕（可保存8～9個月），部分投稿雜志會要求作者提供,。

今天面試,，教授們提了一個問題,，希望與大家共勉。如何確定wb中特異性抗體結(jié)合的蛋白就是我們要的目標蛋白,，首先可以根據(jù)分子量大小判斷,，可以做共沉淀把目標蛋白拉下來送去做質(zhì)譜?？梢詫δど系牡鞍鬃錾V和質(zhì)譜聯(lián)合分析,，另外特異性染色也可以做，抗二抗的抗體可以購買或者自己制作,。

通過向同學(xué)深入的學(xué)習(xí),，還可以做陰性對照和陽性對照。陰性對照（確定不表達或極微量表達目標蛋白的樣品）,，比如基因敲除動物,，對動物做DNA鑒定，確定沒有該蛋白對應(yīng)的基因序列,，再提取蛋白做wb,。陽性對照（確定表達目標蛋白的樣品），比如某種模型或正常組就是會比該種實驗?zāi)Ｐ偷谋磉_高,，可以做wb進行比較,。

技術(shù)是一種手段，但是嚴謹?shù)目蒲兴季S以及善于探索很重要,。