引言：
農桿菌（Agrobacterium tumefaciens）是植物基因工程中重要的載體工具，其感受態(tài)細胞的制備質量直接影響外源基因的轉化效率,。本文將詳細介紹農桿菌感受態(tài)細胞的標準化制備流程,，結合實驗優(yōu)化技巧與注意事項，助您提升轉化成功率,，滿足科研與產業(yè)化需求,。
一,、什么是農桿菌感受態(tài)細胞？
感受態(tài)細胞指通過物理或化學處理使細菌處于易于吸收外源DNA的狀態(tài),。農桿菌感受態(tài)細胞的制備是植物轉基因實驗的關鍵步驟,，直接影響Ti質粒的轉化效率。目前主流方法為CaCl?化學法,，具有成本低,、操作簡便的優(yōu)勢。
二,、實驗材料準備
菌株選擇：常用EHA105,、GV3101等致病性缺失型農桿菌
培養(yǎng)基：YEB液體培養(yǎng)基（配方：5g/L牛肉膏，1g/L酵母提取物,，5g/L蛋白胨,，5g/L蔗糖，0.5g/L MgSO?·7H?O,，pH7.0）
試劑：無菌0.1M CaCl?溶液,、液氮、50%甘油
設備：超凈工作臺,、離心機,、恒溫搖床、-80℃冰箱
三,、分步制備流程（含關鍵參數）
步驟1：菌種活化與擴增
取-80℃保存的農桿菌劃線接種于YEB固體培養(yǎng)基,，28℃倒置培養(yǎng)48小時
挑取單菌落接種至5mL YEB液體培養(yǎng)基，28℃,、200rpm振蕩培養(yǎng)16-18小時
優(yōu)化提示：OD???達0.4-0.6時菌體處于對數生長期,，此時收獲細胞活性最佳
步驟2：菌體收集與預冷處理
將菌液轉移至預冷的50mL離心管，冰浴10分鐘
4℃,、5000g離心10分鐘,，棄上清
加入10mL預冷0.1M CaCl?溶液，輕柔重懸菌體
冰浴30分鐘,，再次4℃離心10分鐘
關鍵點：全程保持低溫（0-4℃）,，防止菌膜結構受損
步驟3：感受態(tài)細胞制備
棄上清，加入2mL預冷0.1M CaCl?溶液（含15%甘油）
輕柔吹打重懸,，分裝至1.5mL離心管（每管100μL）
液氮速凍1分鐘后轉入-80℃長期保存
配方優(yōu)化：添加終濃度10mM MgCl?可提升DNA結合效率
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