為了排除某些因素對PCR結(jié)果的影響,，PCR實(shí)驗(yàn)需要對照實(shí)驗(yàn)。PCR的陽性對照是Marker,，推測PCR產(chǎn)物長度,，判斷PCR產(chǎn)物是否是目的片段。PCR的陰性對照是PCR的空白管,，除了模板不加之外,，其成分與其他管一樣，證明沒有其他模板污染,。下面讓我們一起來看看PCR和凝膠電泳實(shí)驗(yàn)結(jié)果常見的問題及原因分析吧,！
一、耗材選擇不當(dāng)對實(shí)驗(yàn)結(jié)果造成很大的影響
PCR耗材一般都是聚丙烯(PP)材質(zhì),，因其為生物學(xué)惰性材料,，表面不易于粘附生物分子，且有著良好的化學(xué)耐性,，及溫度耐受性,。這些材料通常會(huì)與試劑或者樣品直接接觸，因而在生產(chǎn)制備過程中需要選用高質(zhì)量的材料和良好的加工工藝,。
PCR管的體積大多數(shù)都可以滿足PCR反應(yīng)要求,。但是在滿足實(shí)驗(yàn)要求的基礎(chǔ)上，優(yōu)先推薦選用低容管,。因?yàn)榈腿莘磻?yīng)管有著較小的上方空間,，可提高熱傳導(dǎo)率并降低蒸發(fā)。而且在加樣時(shí),，需要避免加樣過量或過少,。過量會(huì)導(dǎo)致熱傳導(dǎo)率下降，溢出及交叉污染,，而加樣過少可能會(huì)造成樣品蒸發(fā)損失,。
二、假陰性(無擴(kuò)增產(chǎn)物)——現(xiàn)象：陽性對照有條帶,，而樣品則無
原因：模板含有抑制物,，含量低；緩沖液(Buffer)對樣品不合適,；引物設(shè)計(jì)不當(dāng)或者發(fā)生降解,；反應(yīng)條件：退火溫度太高，延伸時(shí)間太短,。
對策：純化模板或者使用試劑盒提取模板DNA或加大模板的用量,；更換Buffer或調(diào)整濃度,；重新設(shè)計(jì)引物(避免鏈間二聚體和鏈內(nèi)二級結(jié)構(gòu))或者換一管新引物；降低退火溫度,、延長延伸時(shí)間,。
三、非特異性擴(kuò)增——條帶與預(yù)計(jì)的大小不一致或者非特異性擴(kuò)增帶
原因：引物的特異性不強(qiáng),、提取模板DNA中可能會(huì)有非靶基因性同源序列,；模板或引物濃度過高；酶量過多,；Mg2+濃度偏高,；退火溫度偏低；循環(huán)次數(shù)過多,。
對策：重新設(shè)計(jì)引物,；適當(dāng)降低模板或引物濃度；適當(dāng)減少酶量,；降低鎂離子濃度,；適當(dāng)提高退火溫度則減少與同源性非靶DNA的互補(bǔ)程度；減少循環(huán)次數(shù),。四,、拖尾——產(chǎn)物在凝膠上呈模糊不清狀態(tài)(彌散)
原因：模板不純；引物濃度不夠優(yōu)化,；Buffer不合適,；退火溫度偏低；酶量過多,；dNTP,、Mg2+濃度偏高；循環(huán)次數(shù)過多,。
對策：純化模板,；對引物進(jìn)行梯度稀釋；更換Buffer,；適當(dāng)提高退火溫度,；適量用酶；適當(dāng)降低dNTP和鎂離子的濃度,；減少循環(huán)次數(shù),。
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