質(zhì)粒最早是20世紀50年代初期在大腸桿菌中發(fā)現(xiàn)的，是細菌,、酵母菌,、放線菌等生物中獨立于染色體(或擬核)以外的閉合環(huán)狀雙鏈DNA分子，具有自主復制能力,，可在子代細胞中保持恒定的拷貝數(shù),，并表達所攜帶的遺傳信息。那么你知道影響質(zhì)粒構建實驗的因素有什么嗎,？讓我們一起來看看吧,！
一、載體的選擇
在選取克隆載體時應留意以下幾點：
?、倬邆渥灾鲝椭颇芰?，拷貝數(shù)量眾多；
?、跀y帶易于篩選的選擇標記,；
③含有多種限制酶識別序列,，以供外源基因插入,；
二、引物設計留意事項
在構建質(zhì)粒時,，設計引物時應考慮引物長度,、引物的GC含量、引物的Tm值等因素,，并避免引物間出現(xiàn)配對突變或次級結(jié)構等情況,。
前向引物：5’端–上游克隆載體末端同源序列 + 基因正向擴增引物 --3’端
反向引物：3’端–基因反向擴增引物 + 下游克隆載體末端同源序列 --5’端
在運用PCR擴增目的基因的過程中，引物設計需留意事項：
?、?引物長度最好在18-30bp左右,，常用的長度是 20-22bp,；
②引物 Tm 值最好在 60℃ 左右,，兩條引物間 Tm 值要保持接近,，相差最好不要超過 5°C；
?、跥C 的含量標準通常為 40%-60% 或45-55%,；
三、酶切位點的選擇
在構建質(zhì)粒時,，選擇適當?shù)那懈蠲负瓦B接酶至關重要,。對于切割酶的選擇，應該考慮到酶切位點的位置以及酶的反應條件等因素,。而對于連接酶的選擇,，則應根據(jù)所使用的質(zhì)粒載體和目標基因的大小來確定。
?、龠x擇質(zhì)粒上兩個酶切位點之間的距離不宜過小(>10bp)，否則會影響限制性內(nèi)切酶對切點的識別,，從而不利于空載體的雙重酶切,。
②在克隆表達目的基因的情況下,，選擇酶切位點時應考慮以下因素：
目標基因片段內(nèi)不應含有所選酶切位點(否則在檢驗陽性重組子的雙重酶切時可能會切斷目標基因),。
③在后續(xù)實驗中使用的所有載體(真核,、原核,、酵母、昆蟲)盡可能含有所選的酶切位點,，并且要確保插入載體時的方向正確(即定向克隆),，以免在更換載體進行表達時需要重新設計引物以引入新的酶切位點。
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