產(chǎn)品名稱：abclonal愛博泰克SARS-CoV-2 ORF6抗體(A20324)現(xiàn)貨供應(yīng)
產(chǎn)品貨號(hào)：A20324
產(chǎn)品品牌：abclonal愛博泰克
產(chǎn)品背景：嚴(yán)重急性呼吸系統(tǒng)綜合癥冠狀病毒2（SARS-CoV-2）是一種包膜,、正義,、單鏈RNA病毒，可引起2019年冠狀病毒病,。病毒顆粒包括侵襲宿主細(xì)胞所需的RNA遺傳物質(zhì)和結(jié)構(gòu)蛋白,。一旦進(jìn)入細(xì)胞,，感染RNA就被用來編碼構(gòu)成病毒顆粒的結(jié)構(gòu)蛋白，指導(dǎo)病毒組裝,、轉(zhuǎn)錄,、復(fù)制和宿主控制的非結(jié)構(gòu)蛋白，以及功能尚未確定的輔助蛋白~ORF6編碼病毒輔助蛋白,?；谄渑c其他冠狀病毒蛋白的相似性,，ORF6蛋白被認(rèn)為在病毒發(fā)病機(jī)制中發(fā)揮作用,。
實(shí)驗(yàn)方案：蛋白質(zhì)印跡實(shí)驗(yàn)：
1、樣品制備
（1）細(xì)胞收集
a. 貼壁培養(yǎng)細(xì)胞收集
用細(xì)胞刮刮下細(xì)胞或用胰酶消化處理后,，400×g,，離心5 min，棄上清,；用適量冰PBS溶液將離心后細(xì)胞沉淀重懸,，4℃，400×g 離心5min,棄上清,，重復(fù)清洗步驟一次收集細(xì)胞沉淀,。
b. 懸浮培養(yǎng)細(xì)胞收集
收集懸浮細(xì)胞，400×g離心5min,，棄上清,，適量冰PBS溶液將離心后細(xì)胞沉淀重懸，4℃,，400×g 離心5min,棄上清,，重復(fù)清洗步驟一次，收集細(xì)胞沉淀,。
c. 組織樣本收集
把組織在預(yù)冷的表面上剪切成細(xì)小碎塊,，然后用液氮或超低溫冰箱中冷凍組織30min以上，迅速加液氮研磨,，研磨過程盡量控制在1~2min之內(nèi),，以減少蛋白的降解。
（2）總蛋白提取
a. 細(xì)胞/組織裂解：
根據(jù)收集的細(xì)胞數(shù)量,、細(xì)胞種類添加適量的裂解液,。
例如常規(guī)細(xì)胞沉淀可按照1mL裂解液/107個(gè)細(xì)胞的比例加入相應(yīng)體積的裂解液，加入裂解液后將沉淀吹打混勻,。使用細(xì)胞破碎儀超聲樣本,，每次超聲時(shí)間4-5s,間隔時(shí)間在5s左右，肉眼觀察,，樣本為均一,，不粘稠液體即可,。或采用震蕩裂解方式進(jìn)行,，每隔5min將離心管置于渦旋振蕩儀上震蕩10s,，裂解20min。
組織碎片可按照0.5mL 裂解液/100mg組織向勻漿器中加入蛋白裂解液,，每3min研磨一次,，重復(fù)5次，使組織盡量碾碎（裂解液中根據(jù)需要添加或不添加蛋白酶抑制劑）,。所有理解過程,，務(wù)必在低溫條件下進(jìn)行。
b. 離心：
把裂解好的樣品配平后,，將裂解好的樣本置于預(yù)冷的高速冷凍離心機(jī)中,，13000×g離心10min，收集上清
c. 蛋白變性：
吸取少量蛋白提取液做蛋白濃度測(cè)定,。向剩余的蛋白提取液的離心管中加入對(duì)應(yīng)體積的5× Loading Buffer（最終工作液為1×),，待干式恒溫器溫度升至95℃后，將1.5mL離心管插入加熱孔中,，95℃加熱變性10min,，待液體冷卻后置于-20℃保存。
（3）蛋白濃度測(cè)定（BCA法）
a. BCA工作液的配置
根據(jù)樣品數(shù)量,，按50體積BCA試劑A加入1體積BCA試劑B（50:1）配置適量BCA工作液,，充分混勻。BCA工作液室溫24h內(nèi)穩(wěn)定,。
b. BSA標(biāo)準(zhǔn)品梯度稀釋
取10μl蛋白標(biāo)準(zhǔn)品（5 mg/mL BSA）稀釋至50μl,，使終濃度為1mg/ml。稀釋后的蛋白標(biāo)準(zhǔn)品可以-20℃長期保存,。此標(biāo)準(zhǔn)品溶液的稀釋液可使用去離子水或1×PBS,。將標(biāo)準(zhǔn)品按0、1,、2,、4、8,、12,、16、20μl加入到96孔板中,，加稀釋液補(bǔ)足到20μl,。
c. 樣本濃度測(cè)定
加適當(dāng)體積樣品到96孔板的樣品孔中，如果樣本不足20μl,，需加稀釋液補(bǔ)足到20μl,。每孔加入 200μl BCA工作液,，37℃放置20-30min。用酶標(biāo)儀測(cè)定樣本和標(biāo)準(zhǔn)品在562nm下的吸光度,，或在540-595nm之間波長下的吸光度,。根據(jù)BSA蛋白濃度標(biāo)準(zhǔn)曲線和使用的樣品體積計(jì)算出樣品的蛋白濃度。
2,、凝膠電泳
（1）制膠器安裝
根據(jù)使用說明書安裝,。
（2）凝膠配置
根據(jù)目標(biāo)蛋白大小，選擇不同合適濃度的分離膠（見附表）,。注意該過程注意不能有氣泡產(chǎn)生,。
（3）上樣
待膠凝固好后，用移液器吸取樣品垂直梳孔上樣,，建議總蛋白上樣量25ug/孔,。注意內(nèi)槽Tris-Glycine SDS Running Buffer需注滿，外槽Tris-Glycine SDS Running Buffer沒過底部3~5cm即可,。
（4）電泳
上樣完成后，連通電泳儀電源,，注意正負(fù)極需連接正確,，設(shè)定適宜的電泳參數(shù)。建議濃縮膠電泳參數(shù)為恒壓80V,，分離膠采用恒壓120V,。當(dāng)溴酚藍(lán)電泳到凝膠底部時(shí)，停止電泳,，關(guān)閉電泳儀電源,。
3、轉(zhuǎn)膜
（1）準(zhǔn)備工作
a. 轉(zhuǎn)膜緩沖液可提前2h （即開始電泳后）放入-20℃冰箱預(yù)冷,。
b. 根據(jù)膠的面積大小,，將濾紙以及NC膜剪裁至合適尺寸。
c. 建議目的蛋白大于20KD可選擇0.45μm NC膜,；目的蛋白小于20KD可選擇0.2μm的NC膜或0.22μm的PVDF膜,。選擇完畢后將膜放在Western Transfer Buffer中浸泡備用。注意使用PVDF膜需先放入甲醇中浸泡1min左右至均勻浸透,，沒有白點(diǎn)即可放入Western Transfer Buffer中浸泡備用,。
（2）轉(zhuǎn)膜
根據(jù)目的蛋白大小，選擇合適的轉(zhuǎn)膜條件（見附表）,。
4,、封閉
轉(zhuǎn)膜完成后，將膜取出,，放入合適的抗體孵育槽中,，加入Western Blocking Buffer 室溫孵育1h,，加入TBST Buffer洗滌3次，每次5 min,。
5,、抗體孵育
根據(jù)所使用的一抗種類，選擇進(jìn)行下述其中1項(xiàng)的具體步驟
（1）對(duì)于無偶聯(lián)的一抗
a. 將一抗用Western Antibody Dilution Buffer(RK05743)按照抗體說明書推薦比例進(jìn)行稀釋,室溫孵育1.5h或4℃過夜孵育,。
b. TBST Buffer洗滌4次,，每次5 min。
c. 按一抗來源選取合適的HRP偶聯(lián)二抗,，按照合適比例進(jìn)行稀釋,，室溫孵育1h。
d. TBST Buffer洗滌4次,，每次5 min,。
e. 繼續(xù)進(jìn)行后續(xù)曝光操作。
（2）對(duì)于偶聯(lián)有HRP的一抗
a. 將一抗用Western Antibody Dilution Buffer(RK05743)按照抗體說明書推薦比例進(jìn)行稀釋,室溫孵育1.5h或4℃過夜孵育,。
b. 用TBST Buffer洗滌4次,，每次5 min。
c. 繼續(xù)進(jìn)行后續(xù)曝光操作,。
6,、曝光
a. 吸取等體積ECL SolutionⅠ和SolutionⅡ混勻，配制成發(fā)光檢測(cè)工作液,。推薦用量為每10cm2的膜使用1-2 mL發(fā)光檢測(cè)工作液即可,。
b. 用鑷子將膜取出，膜的下緣輕輕接觸吸水紙,，去除膜上多余的液體,。用移液槍吸取工作液并均勻覆蓋轉(zhuǎn)印膜，室溫孵育 1-2 minutes,，此步驟可在潔凈保鮮膜上或塑料盒中完成,。
c. 獲取WB結(jié)果：
1) 傳統(tǒng)壓片曝光顯影：將膜固定于片夾內(nèi)。暗室內(nèi)壓片1分鐘,，立即顯影定影,，根據(jù)結(jié)果再調(diào)整壓片時(shí)間獲取最佳信噪比圖片?；蛑苯臃謩e壓片 30 秒,、1、3,、5分鐘,，然后一起顯影定影觀察結(jié)果。
2) 化學(xué)發(fā)光成像儀獲取電子圖片：將膜放置到成像儀內(nèi)，參考儀器說明書設(shè)置合適的參數(shù)以獲取優(yōu)化圖片,。同時(shí)應(yīng)根據(jù)靶蛋白的生物學(xué)性質(zhì)如豐度等來調(diào)節(jié)成像參數(shù),。
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貨號(hào) | 產(chǎn)品名稱 | 規(guī)格 |
A20324 | SARS-CoV-2 ORF6抗體 | 50 µl |
100 µl | ||
200 µl |
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