q是指在PCR體系中加入熒光染料或熒光探針,，利用熒光信號(hào)積累實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)整個(gè)PCR進(jìn)程,，最后通過(guò)C-值和標(biāo)準(zhǔn)曲線對(duì)未知模板進(jìn)行定量分析的方法,。那么你知道qPCR實(shí)驗(yàn)的注意事項(xiàng)有哪些嗎？讓我們一起來(lái)看看吧,！
一,、模板制備
在進(jìn)行qPCR實(shí)驗(yàn)時(shí)，需要根據(jù)所用試劑盒說(shuō)明書加入適量的起始核酸模板,，過(guò)多的模板可能提高污染物含量,，大大降低 PCR 效率，過(guò)少的模板可能會(huì)降低檢測(cè)靈敏性和重復(fù)性,。
根據(jù)檢測(cè)靶標(biāo)的性質(zhì)特點(diǎn),，選擇合適的核酸抽提試劑盒同樣至關(guān)重要。小編有遇到老師想要通過(guò)qPCR的方法完成對(duì)microRNA的定量,，但是發(fā)現(xiàn)待檢測(cè)樣本中目標(biāo)microRNA和內(nèi)參基因的擴(kuò)增曲線出峰時(shí)間都比較晚,，內(nèi)參基因的Ct值甚至大于30(圖2)。排除實(shí)驗(yàn)操作問(wèn)題后發(fā)現(xiàn)原來(lái)是因?yàn)樗褂肦NA抽提試劑盒對(duì)小片段的microRNA回收效率低,，不適合用于下游microRNA定量實(shí)驗(yàn),。
二、引物探針的設(shè)計(jì)及儲(chǔ)存
除了要保證模板的質(zhì)量外,，引物探針的設(shè)計(jì)和穩(wěn)定性同樣至關(guān)重要,。當(dāng)我們根據(jù)檢測(cè)靶標(biāo)設(shè)計(jì)特異性引物和探針時(shí)，除了要考慮片段長(zhǎng)度,，Tm值,，堿基組成等基本要點(diǎn)外，還需格外注意引物,，探針自身不能形成復(fù)雜的二級(jí)結(jié)構(gòu),，上下游引物內(nèi)部，引物探針之間不能出現(xiàn)結(jié)合的現(xiàn)象,，因?yàn)檫@些都可能影響引物探針與目標(biāo)基因的結(jié)合,，進(jìn)而影響最終的擴(kuò)增效率。
除了引物探針在設(shè)計(jì)時(shí)需要格外花費(fèi)心思外,，收到合成好的引物,、探針如何稀釋，如何保存同樣有小tips,。如果我們合成的引物探針是干粉狀或是需要稀釋時(shí),，為了保證引物探針的穩(wěn)定性建議用1×TE buffer去溶解和稀釋。另外,，引物的儲(chǔ)存濃度也可能影響其穩(wěn)定性,，建議引物的儲(chǔ)存濃度不低于 10 μM，一般為100 μM 。此外如果引物和探針每次使用量較少時(shí),，還應(yīng)該進(jìn)行分裝,，保存在-20℃，以減少反復(fù)凍融的次數(shù),。
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