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       檢測相關(guān)細(xì)胞的生理活性是掌握生物體骨代謝狀態(tài)的有效方法,。骨組織使用堿性磷酸酶（ALP）進(jìn)行染色可明確成骨細(xì)胞的成骨潛能，使用抗酒石酸酸性磷酸酶（TRAP）染色可明確破骨細(xì)胞的骨吸收能力,。并且在同一切片上進(jìn)行二重染色時(shí)，可同時(shí)識別二者

       正常的骨代謝是通過成骨細(xì)胞生長與破骨細(xì)胞建立骨吸收而維持平衡,。成骨細(xì)胞的標(biāo)記酶是堿性磷酸酶（ALP）,。破骨細(xì)胞的標(biāo)記酶是抗酒石酸酸性磷酸酶（TRAP）,。這兩種標(biāo)記酶在組織切片或者培養(yǎng)細(xì)胞過程中，被作為成骨細(xì)胞,、破骨細(xì)胞存在的標(biāo)記指標(biāo),。

       TRAP/ALP破骨成骨雙重染色試劑盒可通過骨組織切片以及培養(yǎng)細(xì)胞中TRAP/ALP酶活性進(jìn)行組織染色。通過觀察成骨細(xì)胞和破骨細(xì)胞的染色成像,，可檢查細(xì)胞的分化狀態(tài)和骨組織的分布情況,。

一、特點(diǎn)：

使用時(shí)混合3種溶液,，可制備TRAP酶活性染色的顯色底物溶液,。

ALP酶活性染色使用的是預(yù)混物溶液，操作簡便,。

TRAP的活性部位呈紅紫色,，ALP的活性部位呈藍(lán)色（茶褐色），可雙重染色,。適用于骨組織切片（脫鈣GMA樹脂包埋切片）以及培養(yǎng)細(xì)胞,。

二、染色方法

染色法是Lorch的Gomori法,。使用的是偶氮染料法和耦合法結(jié)合的TRAP/ALP染色試劑盒,。Lorch推薦切片厚度為8μm，同時(shí)也研究了普通的4μm切片是否能染色,、雙重染色的順序應(yīng)該先染TRAP和ALP中的哪一個(gè),、封片劑是否必須選水溶性封片劑等問題。

染色法結(jié)果：偶氮染料法中切片過厚導(dǎo)致酶擴(kuò)散圖像,。即用TRAP染色骨質(zhì)有紅染傾向,，但即使是4μm厚度，只要增強(qiáng)反應(yīng)條件（反應(yīng)溫度和反應(yīng)時(shí)間）,，也能充分染色的,。換言之，TRAP染色中反應(yīng)溫度從室溫調(diào)至37℃,，反應(yīng)時(shí)間從30分鐘調(diào)至45分鐘或60分鐘,。ALP染色在37℃反應(yīng)45分鐘至3小時(shí)，或者室溫（10-15℃）下反應(yīng)時(shí)間增加至一晚,。此結(jié)果顯示,，兩者色調(diào)平衡，染色效果好,。但是,，反應(yīng)條件的增強(qiáng)導(dǎo)致ALP染色切片產(chǎn)生了很多色素顆粒。另外,，TRAP和ALP的染色順序哪一個(gè)先染色都是可以的,。如果先進(jìn)行ALP染色時(shí),，在TRAP陽性部位呈明顯的紅色，鮮艷處為破骨細(xì)胞,。獲得比較好的標(biāo)本,。但是，ALP的反應(yīng)產(chǎn)物經(jīng)過TRAP溶液處理后,，會產(chǎn)生白色混濁顆粒,，沉淀在組織上。因此,，先TRAP染色,，接著ALP染色的方法是可行的。封裝法是利用甲基綠數(shù)秒間核染色處理,。水洗后,，37℃下干燥，二甲苯浸透,，用馬里醇(Marinol)永jiu封存,。

脫鈣石蠟包埋切片的TRAP/ALP雙重染色

用1年齡小鼠腰椎的EDTA脫鈣石蠟切片，進(jìn)行TRAP/ALP雙重染色,。

TRAP陽性將破骨細(xì)胞染成紅色,，ALP陽性將細(xì)胞活性強(qiáng)的細(xì)胞（成骨細(xì)胞軟骨細(xì)胞）染成褐色。（上：弱擴(kuò)大,，下：強(qiáng)擴(kuò)大）

TRAP和ALP的雙酶染色實(shí)驗(yàn)中通過對固定,、脫鈣、染色進(jìn)行多處改良,，實(shí)現(xiàn)了對脫鈣石蠟標(biāo)本的染色,。但是酶擴(kuò)散圖像對TRAP染色的效果ji佳。出于各種原因的考慮,，關(guān)于固定步驟的影響,，如果固定不充分的話，容易抑制脫鈣水平,。進(jìn)而導(dǎo)致酶擴(kuò)散的發(fā)生,。另外，注意脫鈣本身的影響也是有必要的,?？偠灾头敲撯}標(biāo)本相比較,，脫鈣標(biāo)本的擴(kuò)散圖像更加明顯,。脫鈣會使酶擴(kuò)散變強(qiáng)。

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