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　　質(zhì)粒轉(zhuǎn)染的操作步驟
 

　　轉(zhuǎn)染(transfection)是細(xì)胞在一定條件下主動或被動導(dǎo)入外源DNA片段而獲得新的表型的過程,。質(zhì)粒轉(zhuǎn)染對于哺乳細(xì)胞蛋白的表達(dá)至關(guān)重要，轉(zhuǎn)染的方法和步驟直接影響著轉(zhuǎn)染的成功與否,。那么你知道質(zhì)粒轉(zhuǎn)染的操作步驟有那些嗎,？讓我們一起來看看吧！
 

　　以24孔板培養(yǎng)的哺乳動物細(xì)胞為例：
 

　　一,、種細(xì)胞,；
 

　　1. 貼壁細(xì)胞：轉(zhuǎn)染前一天每孔0.5-2×10E5個細(xì)胞接種于500ul培養(yǎng)基中，在轉(zhuǎn)染時細(xì)胞可長至90-95%匯合度,。
 

　　2. 懸浮細(xì)胞：在配置轉(zhuǎn)染液前每孔4-8×10E5個細(xì)胞接種于500ul培養(yǎng)基中,。
 

　　二、轉(zhuǎn)染液配置,，每孔細(xì)胞用量如下：
 

　　1. 用50ul無血清培養(yǎng)基稀釋質(zhì)粒DNA,，輕輕混勻。
 

　　2. 取適量合適的質(zhì)粒轉(zhuǎn)染試劑在50ul無血清培養(yǎng)基中稀釋,，室溫孵育5min,。
 

　　3. 將前兩步所稀釋的DNA和質(zhì)粒轉(zhuǎn)染試劑混合，輕輕混勻,，室溫放置30min,。
 

　　三、在每孔細(xì)胞中加入混合后的轉(zhuǎn)染液,，輕輕搖勻。
 

　　四,、貼壁細(xì)胞可在轉(zhuǎn)染4-6h后更換培養(yǎng)基,，懸浮細(xì)胞可在轉(zhuǎn)染后18-48h間進(jìn)行細(xì)胞換液，轉(zhuǎn)染18-48h后可檢測基因mRNA水平表達(dá),。如果檢測蛋白表達(dá),，需在轉(zhuǎn)染后48-72h收集細(xì)胞樣品。
 

　　五,、對于穩(wěn)定轉(zhuǎn)染,，在轉(zhuǎn)染24h后以1:10傳代培養(yǎng)，第二天可加入選擇培養(yǎng)基,。
 

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