免疫組化技術(shù)是利用已知的特異性抗體或抗原能特異性結(jié)合的特點,，通過化學反應使標記于結(jié)合后的特異性抗體上的顯示劑通過借助顯微鏡的觀察，從而在抗原抗體結(jié)合部位確定組織細胞結(jié)構(gòu)的一門組化技術(shù),。那么影響免疫組化實驗結(jié)果的因素有哪些呢,？讓我們一起來看看吧！
一,、組織的固定
組織固定的好壞直接影響免疫組化的結(jié)果,，選擇良好的固定液并及時充分的固定可以防止組織自溶，最大限度保留組織的抗原性,，保證免疫組化結(jié)果的準確性,。
常用固定液：
10%的中性緩沖福爾馬林（40%甲醛10ml+0.01mol/LPBS90ml(pH7.4)），一般固定液的量為組織塊體積的4~10倍,，固定時間（常溫條件下固定8~24h）。
二,、組織的脫水
組織脫水不che底,，會出現(xiàn)組織掉片的現(xiàn)象,，而且顯色效果差，容易混淆診斷,。
為保證組織脫水che底,，應制定相應的更換試劑的制度，及時更換并有專人負責,，做好相應的記錄,。
三、切片
玻片選擇粘附載玻片,，切片不宜厚,，推薦厚度3~5μm，可以保證后續(xù)修復時最大限度暴露抗原,。切片無皺褶,、無氣泡，烤片溫度設置65~68℃,，時間為3小時,。烤片不充分會導致組織脫片影響后續(xù)的檢測,，但烤片也不宜過度,，溫度過高會加速抗原氧化，導致抗原丟失,。
四,、阻斷內(nèi)源酶
進行免疫組化標記的組織，通常含有一定量的內(nèi)源性酶,，由于在免疫組化染色過程中,，大部分抗體是用過氧化物酶來標記的。
比如我們通常使用HRP即辣根過氧化物酶標記的二抗,，酶起催化作用,，促進底物的結(jié)合，而組織中的內(nèi)源性酶同樣也能催化底物,，這就影響了免疫組化的特異性,。所以在加酶標二抗之前，應先用過氧化氫阻斷內(nèi)源酶,，將對后續(xù)檢測結(jié)果的影響降到zui低,。
五、抗體的選擇和使用
選用與使用的一抗同源性的二抗,。要選擇適宜的一抗,，不同的二抗與一抗?jié)舛炔黄ヅ洌疾荒艿玫綕M意的結(jié)果,。
在滴加一抗,、二抗時要先輕輕傾去PBS液,，選用韌性好、吸水性強的紙巾吸干組織周圍液體,，輕壓組織面吸干組織表面水分(不能滑動),，防止試劑被稀釋或致濃度不均，立即滴加適量試劑,，用細玻棒將試劑擴展至組織外1～2mm,，防止出現(xiàn)邊緣效應，不能觸碰組織,，液面厚約1mm為宜,。
一抗孵育溫度一般設置37℃1小時或者4℃冰箱孵育過夜，二抗室溫孵育30-60min,。為保證實驗結(jié)果的可靠性,，推薦在實驗中設置同片的陽性對照和陰性對照。
試劑表面的氣泡用玻棒點破,，否則氣泡張力作用會導致局部無試劑,，出現(xiàn)氣泡下假陰性反應。
六,、顯色反應
DAB顯色劑須現(xiàn)配現(xiàn)用,，切片多時應分次配制，分批顯色,。根據(jù)溫度和整體顯色情況決定終止反應,，一般顯色時間3～5min，時間過長致顯色過深和背景著色,，過短致反應不足或出現(xiàn)假陰性,。
由于DAB有一定的毒性，在操作時要特別注意自身的防護,，實驗器材專用,，以防污染。
七,、試劑的保存
因為抗體是蛋白質(zhì),，保存或使用不當不但會造成浪費，而且變質(zhì)會出現(xiàn)假陰性結(jié)果,。
要注意抗體的有效期,，對于一次用不完的抗體可保存在冰箱內(nèi)，而不要放在冷凍室,，反復凍融,，抗體效價會急劇下降而失效。
同時防止抗體的相互交叉污染和細菌污染。
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