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熒光原位雜交是一門新興的分子細(xì)胞遺傳學(xué)技術(shù),，目前這項(xiàng)技術(shù)已經(jīng)廣泛應(yīng)用于動(dòng)植物基因組結(jié)構(gòu)研究,、染色體精細(xì)結(jié)構(gòu)變異分析、病毒感染分析、人類產(chǎn)前診斷,、腫瘤遺傳學(xué)和基因組進(jìn)化研究待許多領(lǐng)域,。那么你知道熒光原位雜交實(shí)驗(yàn)的方法與步驟是什么嗎,？讓我們一起來看看吧！

一,、探針變性

將探針在 75℃恒溫水浴中溫育 5 min,，立即置 0℃，5～10 min,，使雙鏈 DNA 探針變性,。

二,、標(biāo)本變性

（1）將制備好的染色體玻片標(biāo)本于 50℃培養(yǎng)箱中烤片 2～3 h,。（經(jīng) Giemsa 染色的標(biāo)本需預(yù)先在固定液中退色后再烤片）,。

（2）取出玻片標(biāo)本,，將其浸在 70～75℃的體積分?jǐn)?shù) 70% 甲酰胺/2×SSC 的變性液中變性2～3 min,。

（3）立即按順序?qū)?biāo)本經(jīng)體積分?jǐn)?shù) 70%,、體積分?jǐn)?shù) 90%和體積分?jǐn)?shù) 100%冰乙醇系列脫水,，每次 5 min,，然后空氣干燥。

三,、雜交

將已變性或預(yù)退火的 DNA 探針 10 μL 滴于已變性并脫水的玻片標(biāo)本上,，蓋上 18×18 蓋玻片，用 Parafilm 封片,，置于潮濕暗盒中 37℃雜交過夜（約 15～17 h）,。由于雜交液較少，而且雜交溫度較高,，持續(xù)時(shí)間又長,，因此為了保持標(biāo)本的濕潤狀態(tài)，此過程在濕盒中進(jìn)行,。

四,、洗脫

此步驟有助于除去非特異性結(jié)合的探針，從而降低本底,。

（1）雜交次日,，將標(biāo)本從 37℃溫箱中取出，用刀片輕輕將蓋玻片揭掉,。

（2）將已雜交的玻片標(biāo)本放置于已預(yù)熱 42～50℃的體積分?jǐn)?shù) 50%甲酰胺/2×SSC 中洗滌3 次，每次 5 min,。

（3）在已預(yù)熱 42～50℃的 1×SSC 中洗滌 3 次,，每次 5 min,。

（4）在室溫下,，將玻片標(biāo)本于 2×SSC 中輕洗一下。

（5）取出玻片,，自然干燥,。

（6）取 200 μL 復(fù)染溶液（PI/antifade 或 DAPI/antifade 染液）滴加在玻片標(biāo)本上,，蓋上蓋玻片。

五,、雜交信號(hào)的放大（適用于使用生物素標(biāo)記的探針）

（1）在玻片的雜交部位加 150 μL 封閉液 I，用保鮮膜覆蓋,，37℃溫育 20min,。

（2）去掉保鮮膜,，再加 150 μL avidin-FITC 于標(biāo)本上，用保鮮膜覆蓋,，37℃繼續(xù)溫育 40 min,。

（3）取出標(biāo)本，將其放入已預(yù)熱 42～50℃的洗脫液中洗滌 3 次,，每次 5 min,。

（4）在玻片標(biāo)本的雜交部位加 150 μL 封閉液 II,，覆蓋保鮮膜，37℃溫育 20 min,。

（5）去掉保鮮膜，加 150 μL antiavidin 于標(biāo)本上,，覆蓋新的保鮮膜，37℃溫育 40 min,。

（6）取出標(biāo)本,，將其放入已預(yù)熱 42～50℃的新洗脫液中,，洗滌 3 次，每次 5 min,。

（7）重復(fù)步驟（1）,、（2）,、（3）,，再于 2×SSC 中室溫清洗一下,。

（8）取出玻片，自然干燥,。

（9）取 200 μL PI/antifade 染液滴加在玻片標(biāo)本上,，蓋上蓋玻片,。

六、封片

可采用不同類型的封片液,。如果封片液中不含有 Mowiol（可使封片液產(chǎn)生自封閉作用），為防止蓋片與載片之間的溶液揮發(fā),，可使用指甲油將蓋片周圍封閉,。封好的玻片標(biāo)本可以在-20～-70℃的冰箱中的暗盒中保持?jǐn)?shù)月之久,。

七,、熒光顯微鏡觀察FISH結(jié)果

先在可見光源下找到具有細(xì)胞分裂相的視野，然后打開熒光激發(fā)光源,，F(xiàn)ITC 的激發(fā)波長為490 nm,。細(xì)胞被 PI 染成紅色，而經(jīng) FITC 標(biāo)記的探針?biāo)诘奈恢冒l(fā)出綠色熒光,。

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