熒光標記在生物學眾多的研究領域中有著十分廣泛的應用，已經(jīng)成為研究體內(nèi)或細胞成像及生物細胞功能的重要工具,。熒光標記方式一般有兩種,，一種是細胞表達的熒光蛋白，另外一種是化學合成的熒光分子,，此外,，螢光素酶也是細胞標記的常用方法。每一種熒光分子都有其獨te的激發(fā)波長和發(fā)射波長,。螢光素酶不同于熒光分子,，其發(fā)光機制是利用酶與底物的反應，催化發(fā)出的化學發(fā)光,，其發(fā)光并不需要激發(fā)光的參與,，常用于體內(nèi)成像及螢光素酶報告基因的定量實驗。熒光蛋白如何選擇呢,？讓我們一起來看看吧,！
一、激發(fā)波長/發(fā)射波長
每一種熒光蛋白都有其獨te的激發(fā)波長和發(fā)射波長,，因此,，選擇的熒光蛋白必須是手上系統(tǒng)能夠激發(fā)和檢測得到的。舉例,，如果你的顯微鏡只有488nm和561nm兩個激發(fā)器,，那你就不能夠選擇遠紅外熒光蛋白。又比如當使用不止一個熒光蛋白時,，確保他們的發(fā)射波長沒有重疊,，建議熒光使用先后順序，GFP/RFP/BFP/YFP/CFP,。
二,、寡聚反應
第一代熒光蛋白易于寡聚化，當和目的基因融合表達時,，可能會影響目的基因蛋白的生物學功能,。因此做融合表達時建議使用單體的熒光蛋白，比如mCherry/EGFP,。
三,、氧氣
許多熒光蛋白的成熟需要氧氣，特別是衍生自GFP的那些熒光蛋白,，如EGFP/ECFP/EYFP,。如果這些熒光蛋白處于缺氧環(huán)境，那可能就觀察不到熒光,。
四,、成熟時間
成熟時間是熒光蛋白正確折疊和產(chǎn)生發(fā)色團所需的時間，時間可能是幾分鐘到幾小時,。舉例：superfolder GFP (sfGFP) 和mNeonGFP在37°C所需時間小于10min,；mCherry 需要大概15min；TagRFP 需要大概100min,；DsRed 大概需要10hours,。
五、溫度
溫度會影響熒光蛋白的成熟時間和熒光強度,，比如EGFP適合37°C,，所以EGFP最shi合哺乳動物或者細菌的研究，而GFPS65T相對適合酵母的研究,。
六,、亮度
熒光蛋白的亮度值由消光系數(shù)與量子產(chǎn)率的乘積計算得出。在許多情況下,，將熒光蛋白的亮度與EGFP(設定為1)進行比較,，有一些熒光蛋白非常暗淡（例如TagRFP657,，其具有亮度只有0.1），因此亮度也需要考慮,。
七,、耐光性
長時間暴露在激發(fā)光下，熒光分子被漂白（即失去發(fā)光的能力）,。光穩(wěn)定性可短至100毫秒（如EBFP）或長達1小時（如mAmetrine1.2）,。但是，對于大多數(shù)熒光蛋白來說,，它只需幾秒鐘到幾分鐘,。另外，光穩(wěn)定性可能也會受實驗參數(shù)影響,，例如激發(fā)光強度,，pH或溫度等。
八,、pH穩(wěn)定性
如果計劃在酸性環(huán)境中表達熒光蛋白,，則此參數(shù)非常重要，一些熒光蛋白具有不同的ex/em光譜（例如mKeima）或在pH變化時熒光強度會發(fā)生改變（例如pHluorin,，pHTomato）,，sensGFP在酸性環(huán)境會淬滅，如StubRFP-SensGFP-LC3B自噬探針,。
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