醛基活化瓊脂糖基質(zhì)在制備和使用定制親和層析介質(zhì)方面具有良好的記錄,。將生物特異性配體與醛基活化瓊脂糖偶聯(lián)是一項成功且有據(jù)可查的技術(shù)。
Aldehyde-activated SepFast通過還原胺化反應(yīng)與含有伯胺基團的配體形成化學穩(wěn)定的仲胺鍵,。這種預活化的瓊脂糖基質(zhì)可用于親和層析介質(zhì)的定制,，適用于小規(guī)模和大規(guī)模純化應(yīng)用。
1. 屬性
有2種基質(zhì)可供選擇,，適合各種待偶聯(lián)或純化的分子,。
• Aldehyde-activated SepFast 4 High Flow (4HF) 由高度交聯(lián)的4%珠狀瓊脂糖組成,。其大孔徑適用于偶聯(lián)或純化大分子。它具有高機械剛度,，可在降低背壓的情況下實現(xiàn)高流量,。
• Aldehyde-activated SepFast 6 High Flow (6HF) 由高度交聯(lián)的6%珠狀瓊脂糖組成。其適中的孔徑適用于偶聯(lián)較小的分子,。它也具有高機械剛度,，可在降低背壓的情況下實現(xiàn)高流量。
由于瓊脂糖具有出色的親水性和低非特異性結(jié)合特性,，長期以來一直用于色譜分離,。這些顆粒具有開孔結(jié)構(gòu)，對各種分子具有出色的傳質(zhì)性能,?；|(zhì)通過氧化被激活以產(chǎn)生醛基，它直接與分子中的伯胺基反應(yīng),，在還原劑存在的情況下被固定化,。
Aldehyde-activated SepFast以20%乙醇中的水懸浮液形式提供。
表1 Aldehyde-activated SepFast 4HF/6HF的特性
可耦聯(lián)基團 | -NH2 |
基質(zhì) | SepFast 4HF：高度交聯(lián)的4%瓊脂糖 SepFast 6HF：高度交聯(lián)的6%瓊脂糖 |
粒徑 | 50-150 μm |
活化水平 | > 5 μmol aldehyde /ml medium |
pH穩(wěn)定性 | 3-13（具有配體依賴性） |
化學穩(wěn)定性 | 對偶聯(lián)配體能夠接受的所有常用的水性化學品穩(wěn)定 |
保存 | 4℃-8℃ |
2. 配體固定化
以下是一般的配體偶聯(lián)程序,。
2.1 將目標配體溶解在偶聯(lián)緩沖液中,，0.1 M磷酸鈉，pH 7.0,。一般對于蛋白質(zhì)配體,，凝膠的制備濃度為5 - 20 mg/ml。對于小配體,，凝膠的制備濃度為10 - 100 µmol/ml,。偶聯(lián)緩沖液的體積可以是固定凝膠體積的一半或相同。
2.2 在過濾裝置中用至少5 倍體積的偶聯(lián)緩沖液清洗醛活化凝膠,。
2.3 將洗凈并吸干的凝膠（來自步驟 2.2）轉(zhuǎn)移到步驟 2.1 制備的溶液中,。
如果發(fā)生變化，請調(diào)整 pH 值,。
2.4 將漿液在通風良好的通風櫥中在室溫下混合 2?4 小時,。
2.5 將氰基硼QING化鈉（0.5 g/100 ml 活性凝膠）加入漿液中，過夜,。注意：氰基硼QING化鈉有毒,，應(yīng)格外小心處理。
2.6 用至少 5 倍凝膠體積的偶聯(lián)緩沖液清洗凝膠,。
2.7 在氰基硼QING化鈉存在下,，將凝膠重新懸浮到相同體積的封閉溶液，0.1 M Tris/HCl,，pH 8.0或1 M乙醇胺,，pH 8.0中2-3小時,。
2.8 用5倍體積的0.1 M Tris/HCl + 1 M NaCl，pH 8.0 洗滌凝膠,，然后用5倍體積的0.1 M醋酸鹽緩沖液 + 1 M NaCl,，pH 4.0洗滌凝膠。
2.9 使用前用工作/平衡緩沖液清洗凝膠,。
3. 固定化效率的一般考慮
3.1 pH
還原胺化可以在pH 4 - 10之間非常有效地進行,。但是可以優(yōu)化偶聯(lián)pH以獲得最佳結(jié)果（例如，高偶聯(lián)產(chǎn)率和高配體活性）,。
在配體溶解后要注意調(diào)整偶聯(lián) pH 值,。
3.2 偶聯(lián)方案
應(yīng)避免使用含有氨基的溶液。
可以引入稀釋的某些有機溶劑以提高配體的溶解度,。應(yīng)事先測試此類溶劑的適用性,。
耦合溶液的體積與活化凝膠的體積保持一致。建議使用0.5-1 : 1 v/v的理想比例,。
3.3 鹽
偶聯(lián)緩沖液中鹽的存在（例如0.5 M 或飽和）可以提高固定效率,。
3.4 基礎(chǔ)基質(zhì)中的活化基團
對于某些配體或應(yīng)用，基礎(chǔ)基質(zhì)中的活化水平可能過高,，偶聯(lián)配體的活性可能會降低,。
在降低的 pH 值下偶聯(lián)可能會減少配體分子的連接點。它可以提高偶聯(lián)配體的活性,。活化基團的受控封閉,，例如在添加配體前幾個小時用 5?10 mM 封閉緩沖液孵育凝膠，也可以減少過度偶聯(lián)問題,。
3.5 反應(yīng)時間
可以優(yōu)化偶聯(lián)過程中配體和活化介質(zhì)之間的接觸時間以保持配體的生物活性,。
3.6 還原劑的選擇
其他還原劑如硼QING化鈉可用于偶聯(lián)反應(yīng)。氰基硼氫化物是一種較溫和的還原劑,，它只還原醛基和伯胺基之間形成的中間席夫堿，得到穩(wěn)定的仲胺鍵,。硼氫化物是一種更強的還原劑,，可還原席夫堿和未偶聯(lián)的醛基。
3.7 屏蔽剩余的活化配體
未與配體反應(yīng)的活化基團應(yīng)通過添加含有pH 8 - 9伯胺的額外小分子（例如 Tris 或乙醇胺）來封端,。
3.8 最終介質(zhì)的洗滌
偶聯(lián)反應(yīng)后需要將未連接或弱連接的配體WAN全洗掉,。采用高pH值和低pH值交替的洗滌方法可以確保有效去除不需要的物質(zhì)。
4. 固定化親和介質(zhì)的使用
配體偶聯(lián)介質(zhì)可用于使用間歇攪拌罐模式或填充柱模式的純化,。處理這種材料遵循與處理其他基于瓊脂糖基質(zhì)相同的原則,。
5. 儲存
Aldehyde-activated SepFast應(yīng)在8℃下儲存。偶聯(lián)的濕介質(zhì)應(yīng)在防菌劑（例如20%乙醇）存在的情況下于4-8℃儲存,。切勿凍存耦合介質(zhì),。
6. 更多信息
了解更多關(guān)于BioToolomics產(chǎn)品聯(lián)系天津益元利康科技有限公司了解產(chǎn)品信息,。
7. 訂購信息
產(chǎn)品 | 規(guī)格 | 貨號 |
Aldehyde-activated SepFast 4HF | 5 mL | 340101-5ML |
50 mL | 340101-50ML | |
1 L | 340101-1L | |
Aldehyde-activated SepFast 6HF | 5 mL | 340104-5ML |
50 mL | 340104-50ML | |
1 L | 340104-1L |
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