材料與儀器
Triton X-100 勻漿緩沖液 酚 氯仿 乙酸鈉 乙醇 氯化鋰
步驟
一 材料與設(shè)備
1)5%TritonX-100
2) 勻漿緩沖液：50 mmol/LNaCl,50 mmol/LTris-Cl,(PH7.5),5 mmol/LEDTA(pH8.0),0.5%SDS,200ug/ml 蛋甶酶 K
3) 酚：氯仿 (1:1)
4)3mol/L 乙酸鈉 (pH5.2),。
5) 乙醇
6)8mol/L 氯化鋰
二 操作方法
1) 將待處理的組織放置下一個(gè)干烤過(guò)的玻璃勻漿器內(nèi)，棄去無(wú)關(guān)的液體,，用 0.5% TriwnX-100 洗滌蠅胚,，以去除培養(yǎng)基。
2) 加 10 倍體積的勻漿緩沖液,、立即研磨使組織che底勻漿化,。
3) 于 37℃ 將組織勻漿溫育 l h, 間或混勻之。
4）將勻漿移至離心管內(nèi),，加等體積酚：氯仿（1:1),，劇烈振蕩 1 min，用吊桶式轉(zhuǎn)頭于室溫以 5000 g 離心 l0mim, 使水相和有機(jī)相分開(kāi),。
5) 將上層水相移至另一離心管內(nèi). 按步驟 4 用酚：氯仿（1:1) 再抽提 1 次,。
6) 將水相移至為-管內(nèi)，加 0.1 體積 3mol/L 乙酸鈉 (PH5.2),，混勻,，加 2.5 倍體積冰預(yù)冷的乙醇，冰浴 2 h
7) 于 4°C 以 5000 g 離心 l5 min,，小心去除上淸液,，室溫晾下 RNA 沉淀. 少量水溶解RNA, 加 3 倍體積乙酔,，于—70℃ 儲(chǔ)存?zhèn)溆?/span>.如要除去糖蛋白和卵黃物質(zhì)，則可根據(jù)需要逬行步驟 8)?11)
8) 用少量水重溶 RNA 沉淀,，加等體積經(jīng)髙壓滅菌的 8mol/L 氯化鋰,，混勻，一 20℃放置 3 h 以上,。
9) 于 4℃ 以 10000 g 離心 30 min 沉淀 RNA, 小心棄上清,。
10) 用 70% 乙醇洗滌沉淀，離心片刻,，棄去上清液. 于空氣中晾干核酸沉淀,。
11) 用少量水重溶 RNA, 加 3 倍體積乙醇，于 一 70℃ 儲(chǔ)存?zhèn)溆谩?/span>
注意事項(xiàng)
1) 用氯化鋰沉淀 RNA 從而有助于去除糖蛋白和卵黃物質(zhì)
2) 由于此方法分離的 RNA 量大超過(guò)污染的 DNA 量,，因此不必除去制品中的 DNA,。盡管污染的基因組 DNA 序列不干擾雜交和翻譯，但如果此 RNA 用于構(gòu)建 cDNA 文庫(kù),，則這些 DNA 可能會(huì)引起混亂,，在這種情況下吋用無(wú) RNA 酶的胰 DNaseI 進(jìn)行消化，以去除污染的 DNA
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